Mối liên hệ giữa cấu trúc phân tử và hoạt tính sinh học là vấn đề khoa học lớn và cơ bản của các chất có hoạt tính sinh học nhất là các hợp chất cacbonyl αβ khơng no.
Hiện đại hóa y học cổ truyền nghĩa là phân lập và xác định được cấu trúc phân tử của các chất thực sự có tác dụng chữa bệnh như y học cổ truyền đã sử dụng làm thuốc là vấn đề chiến lược lâu dài và rất cần thiết cho nhu cầu phát triển dược liệu của đất nước và có thể có hy vọng tìm ra chất làm thuốc mới làm mơ hình cho tổng hợp hóa học.
Để đạt được hai mục tiêu trên, việc lựa chọn loại bệnh tật có mơ hình thử nghiệm chính xác và loại cây thuốc dân tộc có cấu trúc phân tử hợp chất cacbonyl αβ khơng no có ý nghĩa quyết định cho sự thành công của nghiên cứu.
Về bệnh tật, chúng tôi chọn bệnh ung thư và bệnh viêm loét dạ dày là hai loại bệnh phổ biến trên thế giới. Bệnh ung thư đang phát triển mạnh nước ta theo thống kê của Viện Nghiên cứu phịng ngừa ung thư Trung ương. Hàng năm có hàng vạn người mắc bệnh mới, hàng vạn người chết vì ung thư. Nguyên nhân là môi trường ngày càng ô nhiễm, thực phẩm ngày càng nhiễm độc… Bệnh viêm loét dạ dày là bệnh phổ biến ở nước ta khoảng 20% dân số; 95% nguyên nhân gây viêm loét dạ dày là do vi khuẩn Helicobater pylori (HP). Vi
khuẩn này tuy mới phát hiện gần đây do các nhà khoa học Úc, những người đã phát hiện phân lập và ni cấy được nó để thử nghiệm và xét nghiệm với các thuốc một cách chính xác. Sự lựa chọn hai bệnh này nhằm đưa các kết quả nghiên cứu vào phục vụ sức khỏe cộng đồng một cách rộng rãi.
Về cây thuốc, cây thứ nhất chúng tôi chọn cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep). Đây là cây thuốc dân tộc nổi tiếng và là cây đặc hữu Việt Nam. Hiện nay chưa có tài liệu thử hoạt tính chống bệnh viêm lt dạ dày của cây này, mặc dù nhân dân sử dụng cây này để chữa bệnh đau dạ dày bao đời nay. Một cây mà hàm lượng các Diterpen khung ent-kaur-16-ene-15-one (Hình 3.1) chiếm đa số, đây là các hợp chất cacbonyl αβ khơng no với nhóm Xeton vịng 5 liên hợp với 1 liên kết đội đầu mạch. Cho đến nay, người ta đã tìm
được 13 loại hợp chất này trong cây khổ sâm Bắc Bộ. Đây là một nguồn nguyên liệu giàu hợp chất cacbonyl αβ khơng no.
Hình 3.1
Trong 13 dẫn xuất ent-kaur-16-en-15-on có nhiều hợp chất có hoạt tính chống ung thư mạnh invitro như đề tài cấp Nhà nước mã số ĐT-ĐL 2005/05 do GS. TSKH Phan Tống Sơn làm chủ nhiệm đề tài đã khẳng định. Nhưng hợp chất nào trong cây khổ sâm Bắc Bộ có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn gây ra bệnh viêm loét dạ dày thì chưa có một tài liệu nào ở trong nước và trên thế giới cơng bố. Do đó, cơ sở khoa học cho việc dân gian dùng cây khổ sâm Bắc Bộ để chữa bệnh viêm loét dạ dày còn bỏ ngỏ. Đây là vấn đề lý thú mà luận án này quan tâm.
Cây thứ 2 chúng tôi chọn là cây gừng gió (Zingiber zerumbet Smith), đây là cây thuốc dân tộc được nhân dân sử dụng để chữa bệnh về tiêu chảy, thấp khớp, cảm cúm. Nó là cây hoang dại và phổ biến ở các tỉnh miền núi nước ta, là cây dễ trồng dễ mọc, cho năng xuất cao, có tinh dầu và hàm lượng Zerumbone lớn. Các nghiên cứu hiện đại cho thấy Zerumbone là chất có hoạt tính ức chế mạnh sự phát triển tế bào ung thư của 18 loại ung thư khác nhau[4] theo cơ chế loại trừ NF-kB. I-kB Kinase hoạt động và thúc đẩy sự tự chết (Apoptosis)[9] của tế bào ung thư. Zerumbone là một Xeton vòng lớn 11 cạnh trong phân tử có một nhóm cacbonyl và 2 liên kết đơi αβ liên hợp ở 2 bên (Hình 3.2).
O OH ACO 1 2 3 4 5 6 7 15 16 17 18 19 20 O
Hình 3.2
Về hoạt động tính chống ung thư của Zerumbone đã có hàng trăm cơng trình đề cập đến. Cơ chế chống ung thư của Zerumbone cũng đã nghiên cứu rõ ràng. Nhưng hoạt tính chống vi khuẩn HP và các vi khuẩn gây tiêu chảy thì chưa có tài liệu nào đề cập đến. Do đó việc dùng gừng gió để chữa trị các bệnh đường ruột chưa có cơ sở khoa học để khẳng định. Đây là vấn đề chúng tôi quan tâm trong luận án này.
Cây số 3 được chọn là cây hoa hịe (Sophora japonica L). Nó là cây được trồng nhiều nhất ở Tiền Hải, Thái Thụy tỉnh Thái Bình. Nhân dân sử dụng hoa để chữa các bệnh về tim mạch, huyết áp. Chất hoạt động sinh học của hoa hịe là Rutin, nó là một flovonoit có cơng thức cấu tạo hình 3.3
Hình 3.3
Rutin là hợp chất cacbonyl αβ không no nhưng liên kết π của nhóm này nằm trong một hệ π liên hợp mang tính thơm của nhân Flavonoit C6-C3-C6.
Cây thứ 4 được chọn là cây nghệ vàng(Curcuma longa L).Nghệ vàng là cây thuốc dân tộc nổi tiếng từ lâu đời. Nhân dân sử dụng đểchữa viêm loét dạ dày[13]. Như trong phần tổng quan đã trình bày hoạt chất chính của nghệ vàng là Curcuminoit là hỗn hợp của 3 loại Curcumin: Curcumin I, Curcumin II, Curcumin III. Cả 3 loại Curcumin này đều có nhóm chức cacbonyl αβ khơng no trong phân tử. Nhưng thành phần chính của các
Curcumin trong nghệ vàng là Curcumin I chiếm 60-70% tổng các Curcumin.Vì vậy, chúng tơi chọn Curcumin I cho nghiên cứu của mình.
Curcumin I có tên khoa học là Bis feruloyl metan cơng thức cấu tạo hình 3.4
Hình 3.4
Đặc điểm cấu tạo phân tử Curcumin I là có 2 nhóm cacbonyl αβ khơng no giống hệt nhau trong phân tử.
Hoạt tính chống ung thư của Curcumin I đã có nhiều tài liệu cơng bố[17], nhưng hoạt tính chống vi khuẩn HP kẻ gây ra trên 90% bệnh đau dạ dày thì chưa có tài liệu nào đề cập đến trong các tạp chí khoa học trong và ngồi nước.Vì vậy đây là vấn đề khoa học lý thú cần nghiên cứu để khẳng định việc dùng nghệ vàng chữa bệnh dạ dày trong dân gian là hợp lý và có cơ sở khoa học.
Những vấn đề trình bày trên cho thấy sự lựa chọn hợp chất cacbonyl αβ không no theo logic: Hợp chất có một nhóm cacbonyl liên hợp với một liên kết đơi ở vị trí αβ (Tonkinin, hình 3.1). Hợp chất có một nhóm cacbonyl liên hợp với hai liên kết đơi ở vị trí αβ ở hai bên (Zerumbone, hình 3.2), hợp chất có một nhóm cacbonyl liên hợp với nhiều liên kết đôi trong một hệ liên hợp mang tính thơm (Rutin, hình 3) và hợp chất có 2 nhóm cacbonyl αβ khơng no giống hệt nhau (Curcumin I hình 3.4). Logic lựa chọn này có thể có nhiều hy vọng tìm ra được những điều lý thú về mối liên hệ giữa hoạt tính sinh học và cấu trúc phân tử hợp chất cacbonyl αβ không no. Sự lựa chọn các cây để thử nghiệm hoạt tính chống các bệnh ung thưhiểm nghèo và bệnh viêm loét dạ dày phổ biển là dựa vào kinh nghiệm của y học dân tộc và các kết quả nghiên cứu của khoa học thế giới.
CH3O HO
OCH3 OH
3.2. Phân lập các hợp chất cacbonyl αβ không no trong các cây thuốc dân tộc đã chọn
3.2.1. Phân lập Tonkinin từ cây khổ sâm Bắc Bộ(Croton tonkinensis Gagnep)
Như phần tổng quan đã trình bày, cây đặc hữu Việt Nam khổ sâm Bắc Bộ là nguồn nguyên liệu giàu hợp chất cacbonyl αβ khơng no có nhiều dẫn xuất của ditecpen ent- kauran. Cho đến nay người ta đã phân lập và xác định cấu trúc được 13 dẫn xuất của ent- Kaur-15-ene-16-one từ cây này. Chúng tôi phân lập hợp chất cacbonyl αβ không no trong cây khổ sâm Bắc Bộ theo tài liệu[14], nhưng thay vì chiết các hoạt chất bằng CH2CH2 chúng tôi chiết bằng hỗn hợp dung mơi n-hexan/EtoAc tỷ lệ 1:1, sau đó phân lập các hợp chất trong cặn chiết bằng sắc ký cột và kết tinh lại sản phẩm trong etanol/nước. Bằng cách này, chúng tơi phân lập được một chất có tinh thể hình kim, khơng màu nóng chảy ở 85- 860C, Rf=0,75 (n-hexan/EtoAc;95/5.V/V hiện màu vàng chanh với Vanillin khi nguội và tím khi nóng. Các hằng số vật lý này không trùng với các hằng số vật lý của ent-Kauran phân lập được từ cây khổ sâm Bắc Bộ đã cơng bố[14], và chúng tơi đặt tên là Tonkinin, có cơng thức cấu tạo phân tử như hình 3.5
Hình 3.5
Phổ hồng ngoại (phụ lục 1) cho thấy trong phân tử có nhóm OH
υ=3482 cm-1, Metyl, Metylen υCH=2945cm-1, nhóm xeton vịng 5 υxeton = 1712 cm-1 liên kết đơi 2 nhóm thế đầu mạch υc=c=1642 cm-1 và σCH=85 cm-1
Phổ13C-MMR (phụ lục 2,3) cho thấy phân tử Tonkinin có 20 nguyên tử cacbon trong đó theo DEPT (phụ lục 4) có 3CH3, 8CH2, 4CH và 5 cacbon bậc 4. Đáng chú ý có nhóm cacbonyl C= 210ppm,liên kêt đơi C = 151.34 và 115,40ppm.
O OH ACO 1 2 3 4 5 6 7 15 16 17 18 19 20
Khối phổ của Tonkinin (phụ lục 6) cho thấy pic phân từ lượng M+=302.Từ các số liệu tìm cho phép xác định công thức phân tử Tonkinin là C20H30O2. Phổ 1H-NMR của Tonkinin (phụ lục 5) thấy rõ một Triplet ở trường trung bình σH =5,34ppm,1H, J=0,9Hz. Đây là Proton của nhóm Metyl cacbon no vịng dãy β (ở vị tri 7) và nhóm Metylen cuối mạch thể hiện ở 2pic. σH =3,95ppm,1H, J=3,5Hz và σH =3,65ppm, d,1H, J=3,6Hz.(ở vị trí 16-17).
Kết hợp các số liệu phổ trên với phổ HMQC (phụ lục 6), HMBC (phụ lục 7) và COSYGP (phụ lục 8) chúng tôi dự kiến cơng thức cấu tạo của Tonkinin như hình 3.4 và có tên là ent-7β-hydroxykaur-16-en-15-on. Đây là một dẫn xuất của ent-Karan được chúng tôi phân lập được từ cây khổ sâm Bắc Bộ số liệu phổ 1H, 13C-NMR, được chỉ ra trên bảng 3.1. Các số liệu này tương đối phù hợp với tài liệu[14].
Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H &13C-NMR của Tonkinin
Số C 13C-NMR 1H-NMR σc ppm σH ppm Số H Dạng pic J Hz 1 40,7 3,30 2H t 2 18,6 2H m 3 37,5 2H t 9.0 4 36,7 5 47,6 1H t 11 6 29,1 2H d 6.0 7 71,5 1H t 0.9 8 59,4 9 53,8 1H t 7.0 10 40,2 11 18,6 2H m 12 33,9 2H m
13 39,09 3,12 1H t 8.0 14 28,9 2H d 7.8 15 210,0 16 151.34 17 115.40 4,8;5,8 2H d,d 18 73,4 3,6;3,9 3H s 19 17,9 0,84 3H s 20 19,0 1.16 3H s 21 20,8 2,1 3H s