1 .3Vài nét về bệnh ung thƣ nguyên nhân gây bệnh
2.5. Các phƣơng tiện nghiên cứu
2.5.1 Các thiết bị nghiên cứu
Phổ IR ghi trên máy Impact 410- Nicolet 760 FT-IQ; Ép viền KBr.
MS ghi trên máy Hewlett Pachard HP5890 Serie II.
Các loại phổ cộng hưởng từ hạt nhân ghi trên máy Brucker Advance 500MHz chuẩn nội TMS, độ chuyển dịch hóa học được biểu thị ppm, hằng số J Hz.
Bảng mỏng sắc ký 60F254 của Merck.
Silicagel cột cỡ 40-60µm của Merck
2.5.2. Các loại hóa chất và dung mơi đều dùng của Merck
2.5.3. Dòng ung thư gan Hep-G2 (Hepatocullutar carcinoma) do NCI cung cấp
Ung thư biểu mô vú MCF7 (Human Breast adenocarcinoma) 20 NCI cung cấp
2.5.4. Helicobacter pylori NCTC 11638 Quốc tế
Helicobacter pylori 524N13 chúng tôi phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng
2.6. Phần thực nghiệm
2.6.1. Phân lập Tonkinin từ cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep)
1a. Mẫu thực vật và phương pháp xử lý:
Mẫu khổ sâm Bắc Bộ thu mua tại Hịa Bình vào tháng 8 năm 2011. Mẫu do TS Nguyễn Quốc Bình, Viện Tài nguyên Thực vật cung cấp.
Mẫu sau khi thu mua loại bỏ các lá vàng úa chỉ lấy những lá xanh tốt không sâu bệnh. Rồi phơi khơ trong phịng và nghiền thành bột có cỡ là 1-1,5mm.
Chiết ngâm ở nhiệt độ phòng, 2kg bột lá khổ sâm Bắc Bộ (đã chuẩn bị ở 2a), bằng 6 lít MeOH chia làm 3 lần, mỗi lần 3 ngày. Gộp dịch chiết MeOH, cất quay chân không ở 600C đến còn 500ml, pha thêm 250ml nước cất và chiết bằng n-hexan để loại hết Bigment rồi pha thêm 250ml nước nữa và dùng 600ml hỗn hợp dung môi n-hexan/ Etylaxetat tỷ lệ thể tích 1:1, mỗi lần 200ml để chiết hoạt chất, gộp dịch chiết làm khô bằng Na2SO4 khan, cất loại dung mơi thu 25g cao H1, hiệu xuất 1,25% tính theo nguyên liệu thô.
Sắc ký cột H1 trên cột dài 120cm, 3cm nhồi silicagel cỡ hạt 40-60µm theo phương pháp nhồi ướt, rửa cột bằng dung môi n-hexan, axeton 2/1; thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 10ml; sắc ký lớp mỏng các phân đoạn thu được và gộp phân đoạn 1535 có sắc phổ giống hệt nhau và có 1 vết: loại dung mơi và kết tinh lại nhiều lần trong hệ dung môi EtOH/ H2o thu được chất rắn, ký
hiệu là Tonkinin, kết tinh hình kim mầu trắng, nóng chảy 85-860C, sắc ký lớp mỏng cho 1 vết Rf=0,72 dung mơi n-hexan/EtOAc 7,5/2,5 V/V hiện màu tím với Vanillin,… Phổ của sản phẩm xem phụ lục 5,6
Các tư liệu phổ của Tonkinin xem phụ lục 1→9 số liệu phổ và phân tích xem phần kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.2.1.
2.6.2. Phân lập Zerumbone từ cây gừng gió(Zingiber zerumbet Smith)
2a. Mẫu thực vật và phương pháp xử lý:
Mẫu củ gừng gió được thu mua tại Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc vào tháng 11 năm 2011. Mẫu do TS Nguyễn Quốc Bình Viện Tài nguyên Thực vật cung cấp.
Mẫu sau khi thu mua được rửa sạch đất và cát loại bỏ phần hư hỏng và nghiền thành bột mịn cỡ 1-2 mm và bảo quản trong tủ lạnh.
Ép thủy lực 2 kg bột củ gừng gió tươi đến khơ kiệt. Nước ép được chiết bằng n-hexan ba lần mỗi lần 150ml; Bã ép cũng được chiết với n-hexan ba lần mỗi lần 150ml trong 3 ngày.
Gộp 2 dịch chiết n-hexan, làm khô bằng Na2SO4 khan rồi cất loại n-hexan thu dấu không phân cực B.
Kết tinh chậm B ở -150C rồi lọc qua phễu thủy tinh G1 thu Zerumbone thô và đầu không phân cực C. Kết tinh phân đoạn Zerumbone thơ trong dung mơi thích hợp n-hexan-axeton-Etylaxetat thu được Zerumbone tinh khiết 4 g. Hiệu xuất theo nguyên liệu tươi 0,2%.
2c. Các thông số vật lý của sản phẩm
Zerumbone thu được kết tinh hình kim, nóng chảy 66-670C, Rf= 0,72 (Etyl axetat, n-hexan 1/9).
Màu vàng chanh với aniline/ H2SO4 2%.
Các phổ xem phụ lục 10 đến 19.
2.6.3. Phân lập Curcumin I (biferuloylmetan) từ cây nghệ vàng(Curcuma longa
L)
3a. Mẫu thực vật và phương pháp xử lý
Củ nghệ vàng da cam (Curcumin lorga L) thu mua tại tỉnh Hưng Yên vào tháng 11 năm 2011 do GS.TSKH Nguyễn Nghĩa Thìn phân loại và giám định.
Mẫu sau khi thu mua được rửa sạch đất cát và loại bỏ phần hư hỏng rồi thái thành lát mỏng 1-2mm, phơi sấy ở ≤ 500C và nghiền thành bột mịn với cỡ hạt ≤ 2mm
3b. Phân lập Curcumin I
Cho 300g bột nghệ vàng đã chuẩn bị (3a) vào buồng chiết và 700ml Toluen vào bình chiết của bộ Soxlec. Tiến hành chiết cho đến lúc dịch chiết trong. Để nguội trong bình chiết xuất hiện kết tủa. Lọc kết tủa thu được 15,2g hiệu xuất 7,06% ký hiệu là C. Sắc ký lớp mỏng C với hệ dung môi
CHCl3/CH3COOH 9/1 V/V cho 3 vết có Rf 0,69; 0,56 và 0,35 hiện màu sắc phổ với tử ngoại cho 3 màu tương ứng vàng, xanh sáng và hồng. Sắc ký C trên cột cao 80cm, đường kính là 1,7cm, nhồi Silicagel cỡ hạt 40-60 µm theo phương pháp nhồi ướt, trong CHCl3 tỷ lệ chất phân tách và chất hấp phụ 1/60, rửa cột bằng CHCl3/ CH3COOH 9/1 V/V với tốc độ 1ml/phút và thu 150 phân đoạn mỗi phân đoạn 5ml. Các phần đoạn 2 đến 32 có sắc phổ giống hệt nhau cả về Rf và màu sắc phổ được gộp lại và loại dung môi thu được 12g chất kết tinh màu vàng và nhiệt độ nóng chảy 183-1840
C; hiệu xuất 78,7% tính theo trọng lượng chất phân tách ký hiệu là C1, các phổ C1 xem phụ lục 20 đến 28. Số liệu phổ và xác định cấu trúc phân tử xem kết quả và thảo luận 3.2.2.
2.6.4. Phân lập Rutin từ hoa hòe (Sophora japonica L)
4a. Mẫu thực vật và phương pháp xử lý:
Nụ hoa hòe nếp được thu mua từ huyện Tiền Hải tỉnh Thái Bình vào tháng 8 năm 2010. Mẫu được GS.TSKH Nguyễn Nghĩa Thìn phân loại và giám định. Mẫu được phơi khô ở 40-500C nghiền thành bột.
4b. Phân lập Rutin
Đun 50g bột hoa hòe với 300ml EtOH 78% có 5% NaDBSA trong 40 phút rồi lọc nóng, bã lọc được đun lại 2 lần nữa. Gộp 3 dịch lọc lại và cơ quay đến 1/4 thể tích rồi axit hóa đến pH=5 bằng HCl 1M. Lọc kết tủa, rửa bằng nước lạnh đến pH=6,5, sấy khô thu được 20g Rutin thô, hiệu xuất 40%. Kết tinh lại Rutin thô trong EtOH/H2O thu được Rutin tinh khiết, có điểm nóng
chảy 195-1970C; Sắc ký lớp mỏng với MeOH/HCOOH 6/4 V/V cho Rf=0,65 hiện màu vàng với Vanillin/H2SO4 2%.
Phổ UV và IR xem phụ lục 29, 30.
2.7. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ gan và ung thƣ vú
- Thực hiện thử nghiệm này tại Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên thuộc Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
2.7.1. Phương pháp phân tích
- Theo phương pháp của Skehan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS (1993) hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) và trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Iilinois, Chicago, Mỹ.
2.7.2. Dòng tế bào
- Dòng Hep –G2 (Hepatocellular carcinoma – Ung thư gan).
- MCF7: Human Breast adenocarcinoma (Ung thư biểu mô vú).
2.7.3. Môi trường nuôi cấy
- DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc MEM (Minimum Essential Medium With Eagle’s salt) Có bổ sung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF (Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone); NAA (Non- Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum).
- Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sufoside); TCA (Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic.
2.7.4. Các dụng cụ dùng 1 lần
- Bình ni cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giếng, Pipet pasteur, các đầu tuýp cho Micopipet
2.7.5. Chất chuẩn chứng dương tính
- Dùng chất chuẩn có khá năng diệt tế bào: Ellipithine, Vinblastine hoặc Taxol pha trong DMSO.
- Đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495-515 nm.
2.7.6. Tính kết quả
- Giá trị CS: Là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo được của chúng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức:
100 100 (%) x inh ODchungâmt ODmâutrang m ODthínghie sc
- Giá trị CS% sau khi tính theo cơng thức trên, được đưa vào tính tốn Excel để tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau: Độ lệch tiêu chuẩn σ
1 ) ( 2 n X Xi
- Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50:
- Giá trị IC50: Dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table Curve theo thang giá trị Logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Cơng thức:
Y: nồng độ chất thử;
X: Giá trị CS (%);
Kết quả thử xem bảng 3.4 và 3.5 phần bàn luận kết quả
2.8. Thử nghiệm hoạt tính chống HP của các hợp chất phân lập đƣợc
- Thử nghiệm này được thực hiện tại Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương.
2.8.1. Phương pháp
- Dựa vào phương pháp thử nghiệm của tổ chức Y tế thế giới (WHO)
2.8.2. Hóa chất và mơi trường
- Thạch máu ngựa 10%
- Khoáng Oxydase
- Dung dịch Catalase
- Urease
2.8.3. Chuẩn bị mơi trường ni cấy có mẫu cần thử tính diệt khuẩn
- Thạch máu cơ bản (Blood agar base) được chuẩn bị theo hướng dẫn của hãng sản xuất (Merck).
- Để nguội thạch đến 500C thêm 10% máu ngựa và huyết dịch của mẫu thử nghiệm.
2.8.4. Chuẩn bị canh khuẩn thử nghiệm
- Vi khuẩn được pha loãng trong dung dịch nước muối sinh lý 8,5‰ đạt nồng độ 3x108
cfu/ml (Mc Faland 1.0).
- Pha loãng bậc 10 đạt nồng độ vi khuẩn thử nghiệm 106 cfu/ml.
2.8.5. Pha loãng mẫu để thử nghiệm: đạt nồng độ 10mg/1ml.
- Các tuýp được lắc, trộn đều cho đến khi lượng bột tan đều thành huyết dịch.
2.8.6. Nuôi cấy chủng vi khuẩn
- Cấy chủng vi khuẩn chuẩn:
H.pylori NCTC 11638 (chủng quốc tế).
Chủng H.Pylori 524N13 (chủng được phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng).
- Helicobacter pylori 133 trên môi trường thạch máu ngựa 10%, ở điều kiện 5-6% O2, 8- 10% CO2, 80-85% N2 (túi Gas CampyGentm Oxoid, Anh), 370C/72h.
2.8.7. Kiểm tra tính diệt khuẩn
- Cấy huyết dịch vi khuẩn 106 lên các đĩa thạch ở các nồng độ khác nhau.
- Cho các đĩa thạch đã cấy vi khuẩn vào bình ni ở điều kiện kiện 5-6% O2, 8-10% CO2, 80-85% N2(túi Gas CampyGentm Oxoid, Anh), 370C/72h.
- Sau 48-72 giờ nhuộm soi khuẩn lạc rồi xác định tính chất sinh vật hoá học của vi khuẩn.
Hình 2.1
Test Urease:
- Test Urease trong bệnh phẩm: Dựa vào khả năng sinh Urease rất mạnh của H.pylori: Cho vào mơi trường urê có phenol làm chỉ thị pH một mẫu bệnh phẩm, lắc đều, để nhiệt độ 370
C/10-15 phút. Urease của vi khuẩn sẽ chuyển urê thành amoniac làm tăng pH môi trường, môi trường sẽ chuyển từ màu vàng sang màu đỏ. Đây là một loại test nhanh, độ nhạy cao 89-98%.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đề tài và mục tiêu
Mối liên hệ giữa cấu trúc phân tử và hoạt tính sinh học là vấn đề khoa học lớn và cơ bản của các chất có hoạt tính sinh học nhất là các hợp chất cacbonyl αβ khơng no.
Hiện đại hóa y học cổ truyền nghĩa là phân lập và xác định được cấu trúc phân tử của các chất thực sự có tác dụng chữa bệnh như y học cổ truyền đã sử dụng làm thuốc là vấn đề chiến lược lâu dài và rất cần thiết cho nhu cầu phát triển dược liệu của đất nước và có thể có hy vọng tìm ra chất làm thuốc mới làm mơ hình cho tổng hợp hóa học.
Để đạt được hai mục tiêu trên, việc lựa chọn loại bệnh tật có mơ hình thử nghiệm chính xác và loại cây thuốc dân tộc có cấu trúc phân tử hợp chất cacbonyl αβ khơng no có ý nghĩa quyết định cho sự thành công của nghiên cứu.
Về bệnh tật, chúng tôi chọn bệnh ung thư và bệnh viêm loét dạ dày là hai loại bệnh phổ biến trên thế giới. Bệnh ung thư đang phát triển mạnh nước ta theo thống kê của Viện Nghiên cứu phòng ngừa ung thư Trung ương. Hàng năm có hàng vạn người mắc bệnh mới, hàng vạn người chết vì ung thư. Nguyên nhân là môi trường ngày càng ô nhiễm, thực phẩm ngày càng nhiễm độc… Bệnh viêm loét dạ dày là bệnh phổ biến ở nước ta khoảng 20% dân số; 95% nguyên nhân gây viêm loét dạ dày là do vi khuẩn Helicobater pylori (HP). Vi
khuẩn này tuy mới phát hiện gần đây do các nhà khoa học Úc, những người đã phát hiện phân lập và ni cấy được nó để thử nghiệm và xét nghiệm với các thuốc một cách chính xác. Sự lựa chọn hai bệnh này nhằm đưa các kết quả nghiên cứu vào phục vụ sức khỏe cộng đồng một cách rộng rãi.
Về cây thuốc, cây thứ nhất chúng tôi chọn cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep). Đây là cây thuốc dân tộc nổi tiếng và là cây đặc hữu Việt Nam. Hiện nay chưa có tài liệu thử hoạt tính chống bệnh viêm loét dạ dày của cây này, mặc dù nhân dân sử dụng cây này để chữa bệnh đau dạ dày bao đời nay. Một cây mà hàm lượng các Diterpen khung ent-kaur-16-ene-15-one (Hình 3.1) chiếm đa số, đây là các hợp chất cacbonyl αβ không no với nhóm Xeton vịng 5 liên hợp với 1 liên kết đội đầu mạch. Cho đến nay, người ta đã tìm
được 13 loại hợp chất này trong cây khổ sâm Bắc Bộ. Đây là một nguồn nguyên liệu giàu hợp chất cacbonyl αβ khơng no.
Hình 3.1
Trong 13 dẫn xuất ent-kaur-16-en-15-on có nhiều hợp chất có hoạt tính chống ung thư mạnh invitro như đề tài cấp Nhà nước mã số ĐT-ĐL 2005/05 do GS. TSKH Phan Tống Sơn làm chủ nhiệm đề tài đã khẳng định. Nhưng hợp chất nào trong cây khổ sâm Bắc Bộ có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn gây ra bệnh viêm lt dạ dày thì chưa có một tài liệu nào ở trong nước và trên thế giới công bố. Do đó, cơ sở khoa học cho việc dân gian dùng cây khổ sâm Bắc Bộ để chữa bệnh viêm loét dạ dày còn bỏ ngỏ. Đây là vấn đề lý thú mà luận án này quan tâm.
Cây thứ 2 chúng tôi chọn là cây gừng gió (Zingiber zerumbet Smith), đây là cây thuốc dân tộc được nhân dân sử dụng để chữa bệnh về tiêu chảy, thấp khớp, cảm cúm. Nó là cây hoang dại và phổ biến ở các tỉnh miền núi nước ta, là cây dễ trồng dễ mọc, cho năng xuất cao, có tinh dầu và hàm lượng Zerumbone lớn. Các nghiên cứu hiện đại cho thấy Zerumbone là chất có hoạt tính ức chế mạnh sự phát triển tế bào ung thư của 18 loại ung thư khác nhau[4] theo cơ chế loại trừ NF-kB. I-kB Kinase hoạt động và thúc đẩy sự tự chết (Apoptosis)[9] của tế bào ung thư. Zerumbone là một Xeton vịng lớn 11 cạnh trong phân tử có một nhóm cacbonyl và 2 liên kết đơi αβ liên hợp ở 2 bên (Hình 3.2).
O OH ACO 1 2 3 4 5 6 7 15 16 17 18 19 20 O
Hình 3.2
Về hoạt động tính chống ung thư của Zerumbone đã có hàng trăm cơng trình đề cập đến. Cơ chế chống ung thư của Zerumbone cũng đã nghiên cứu rõ ràng. Nhưng hoạt tính chống vi khuẩn HP và các vi khuẩn gây tiêu chảy thì chưa có tài liệu nào đề cập đến. Do đó việc dùng gừng gió để chữa trị các bệnh đường ruột chưa có cơ sở khoa học để khẳng định. Đây là vấn đề chúng tôi quan tâm trong luận án này.
Cây số 3 được chọn là cây hoa hòe (Sophora japonica L). Nó là cây được trồng nhiều nhất ở Tiền Hải, Thái Thụy tỉnh Thái Bình. Nhân dân sử dụng hoa để chữa các bệnh về tim mạch, huyết áp. Chất hoạt động sinh học của hoa hịe là Rutin, nó là một flovonoit có cơng thức cấu tạo hình 3.3
Hình 3.3