CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 .VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Streptococcus suis
Để hồn thiện và chuẩn hố các điều kiện của phản ứng PCR, trong đề tài đã sử dụng chủng vi khuẩn Streptococcus suis typ 2 phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng
của ngƣời (từ máu và dịch não tủy) đƣợc lƣu giữ tại Phịng thì nghiệm “ Vi khuẩn Hơ hấp” khoa Vi khuẩn, Viện VSDTTW để tạo bệnh phẩm mô phỏng phục vụ thực nghiệm.
Vi khuẩn S. suis gây bệnh đƣợc kiểm tra dựa trên:
- Tình chất bắt màu trong nhuộm Gram;
- Thử nghiệm Catalaze;
- Phân nhóm huyết thanh Lancefield: S. suis phải thuộc liên cầu nhóm D;
- Xác định tình chất sinh vật hóa học bằng bộ sinh phẩm „API 20 Strep‟ (Bio Mérieux);
- Xác định typ huyết thanh phổ biến gây bệnh cho ngƣời: ngƣng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu S. suis typ 2.
Một số chủng vi khuẩn khác để đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp phát hiện
Một số chủng vi khuẩn gây viêm màng não mủ điển hính nhƣ Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae typ b và một số vi
khuẩn khác cùng nhóm liên cầu nhƣng khơng phải S. suis (Streptococcus pyogenes,
Streptococcus agalactiae) và tế bào bạch cầu ngƣời.
2.1.2. Dịch não tủy nền
Là loại dịch não tủy đƣợc thu thập từ những bệnh nhân có hội chứng não cấp hoặc viêm não vô khuẩn: 100 mẫu dịch não tủy thu đƣợc từ bệnh nhân có hội chứng
não cấp (HCNC) hoặc viêm não vi rút, đã đƣợc khẳng định âm tình với vi khuẩn để tạo bệnh phẩm nền và sử dụng nhƣ mẫu chứng âm tình thật với S. suis.
2.1.3. Dịch não tủy của bệnh nhân đƣợc chẩn đốn lâm sàng viêm màng não cấp tính do S. suis (để đánh giá hiệu quả của quy trình PCR đa mồi đƣợc xây cấp tính do S. suis (để đánh giá hiệu quả của quy trình PCR đa mồi đƣợc xây
dựng trong đề tài):
- 53 mẫu bệnh phẩm từ 53 bệnh nhân đƣợc chẩn đoán lâm sàng viêm màng não mủ do S. suis.
+ 44 mẫu đã đƣợc khẳng định chắc chắn là vi khuẩn S. suis bằng nuôi cấy phân lập.
+ 09 mẫu âm tình trong NCPL nhƣng dƣơng tình với S. suis trong PCR đơn
mồi
- 100 mẫu bệnh phẩm âm tình thực sự với vi khuẩn S. suis (cả bằng phƣơng pháp nuôi cấy và phƣơng pháp PCR), gồm:
+ 29 mẫu từ bệnh nhân ngƣời lớn có các dấu hiệu thần kinh – liệt chi không rõ nguyên nhân/ hội chứng não cấp).
+ 71 mẫu DNT của TE ≤ 24 tháng tuổi khơng có tiền sử dịch tễ liên quan đến lợn/có chẩn đốn xác định VN vi rút hoặc vi khuẩn khác không phải
S. suis nhƣ Hib, phế cầu và não mô cầu (đƣợc lấy trong CT giám sát VMN
mủ ở TE của PTN VKHH).
2.1.4. Sinh phẩm nghiên cứu:
Môi trường và sinh phẩm nuôi cấy định danh vi khuẩn S. suis:
- Môi trƣờng thạch máu cừu 5% (Columbia sheep blood agar plate, BD [Cat. 251165]).
- Dung dịch H2O2 3%
- Bộ API Rapid ID 20 Strep (BioMérieux).
- Bộ kháng huyết thanh Lancefield (BioMérieux)/Streptex (Remel Cat: 30950501])
- Kháng huyết thanh đặc hiệu S. suis typ 2 (serology, Đan Mạch)
- Bộ nhuộm Gram (DIFCO- Becton Dickinson, USA)
- Lam kình và lá kình phủ
Sinh phẩm tách chiết DNA của vi khuẩn:
- High pure PCR Purification Kit (Roche Co.,)
- Lysozyme (MP Biomedicals, Inc. Cat 100834).
- Mutanolysin (Sigma Co.,).
- Triton X 100
Sinh phẩm PCR:
- Ready-To-Go PCR Mastermix Kit (Amersham Co.,) hoặc Hotstartaq Master Mix Kit (QIAgen), mỗi phản ứng bao gồm: Taq poly 2,5 units; 200µM mỗi loại dNTP; 1,5mM MgCl2; 10mM Tris-HCl [pH9,0]; 50mM KCl; BSA [Bovine Serum Albumine].
- 25 mM MgCl2 (Invitrogen/Fermentas)
- Nƣớc tinh sạch (Sartorius).
- Thạch Seakem GTG Agarose và Nusieve GTG Agarose (Cambrex Bio Science Rockland, Inc. USA).
- Đệm điện di: TAE 10x (Promega Corporation USA)
- Chất nhuộm sản phẩm điện di: ethidiumbromide
- Loading buffer (Novagen Co.)
- 100bp ladder (Markers) Novagen Co..
Các cặp mồi:
Đề tài sử dụng các cặp mồi từ tài liệu tham khảo, đánh giá lại từng cặp, tạo tổ
hợp các cặp mồi thoả mãn các yêu cầu nghiên cứu. Bảng 1 trính bày tên và trính tự các cặp mồi đƣợc sử dụng.
Bảng 2.1. Một số trình tự mồi chủ yếu (primer) đƣợc sử dụng trong nghiên cứu [11,25,39,41]
Loại gen Ký hiệu Trình tự Vị trí
Sản phẩm PCR (bp) 16S-rDNA 195s & 489as2
5′- CAG TAT TTA CCG CAT GGT AGA TAT -3′ 5′- GTA AGA TAC CGT CAA GTG AGA A-3′
172-195
469-490
294
Gdh gdh1 &gdh2 5‟-AAG TTC CTC GGT TTT GAG CA-3‟ 5‟-GCA GCG TAT TCT GTC AAA CG-3‟
631-650
1196-1177 566
Gdh Str2-F
Str2-R
5‟-GCA GCG TAT TCT GTC AAA CG-3‟ 5‟-CCA TGG ACA GAT AAA GAT GG-3‟
1177-1196
508-527 688
Epf epf-F
epf –R
5‟-CGC AGA CAA CGA AAG ATT GA-3‟ 5‟- AAG AAT GTC TTT GGC GAT GG-3‟
2401-2419
3143-3124
744
Suilysin Sly-F
Sly-R
5‟-GCT TGA CTT ACG AGC CAC AA-3‟ 5‟-CCG CGC AAT ACT GAT AAG C-3‟
115-134 344-362 248 Arginine deminase arcA-F arcA-R 5‟-TGA TAT GGT TGC TGC TGG TC-3‟ 5‟-GGA CTC GAG GAT AGC ATT GG-3‟
1225-1244 1342-1324 118 Protein được giải phóng bởi muramidase – MRP mrp-F1 mrp-F2 mrp-R
5‟-GAC AGA TGG TGA GGA AAA TGG-3‟ 5‟-ATT GCT CCA CAA GAG GAT GG-3‟ 5‟-TGA GCT TTA CCT GAA GCG GT-3‟
3636-3655 3823- 3804 188 Cấu trúc vỏ polysaccharide (typ HT) cps2J-F cps2J-R 5‟-TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG-3‟ 5‟-TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC-3‟
13918-13937
14415-14396 498
cps2JJ-F
cps2JJ-R
5‟- GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT T-3‟ 5‟- CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC C-3‟
2.1.5. Trang thiết bị, dụng cụ
- Tủ ấm CO2;
- Máy đo DNA (nanodrop);
- Máy ủ nhiệt (Wise Therm)
- PCR Mastercycler epgradient S (Eppendorf)
- Máy điện di (Weal Tec)
- Máy chụp ảnh điện di (UVP)
- Các loại máy ly tâm: Máy ly tâm lạnh 14000 vòng (BioFuge)…
- Spin down (của Eppendorf và Nhật Bản)
- Lam kình và lá kình phủ
- Ống nghiệm 1.5 ml Eppendorf; ống chạy PCR 0,2ml
- Các loại đâu tip có màng lọc chuyên dụng cho SHPT
- Micropipet, Pipet Pasteur
- Que cấy