3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP
Streptococcus suis VÀ MỘT SỐ ĐỘC LỰC PHỔ BIẾN CỦA VI KHUẨN
3.1.1. Tạo bệnh phẩm mô phỏng
Bảng 3.1. Kết quả khẳng định lại đặc tính của vi khuẩn dùng làm mẫu
TT Phƣơng pháp thử nghiệm Kết quả thử nghiệm
1 Tình chất bắt màu Gram Gram (+)
2 Phản ứng catalase Âm tình
3 Xác định nhóm kháng nguyên theo Lancefield Nhóm D
4 Xác định tình chất sinh học Typ huyết thanh 2
Để khẳng định lại các đặc tình của chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng để tạo mẫu bệnh phẩm mơ phỏng, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm các đặc tình của chủng vi khuẩn nhƣ trong bảng 3.1 bao gồm tình chất bắt màu Gram, phản ứng catalase, nhóm kháng nguyên và định týp huyết thanh. Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn đáp ứng đúng các đặc tình của týp huyết thanh 2 của vi khuẩn
Streptococcus suis.
Từ vi khuẩn S. Suis đã đƣợc khẳng định lại, nhóm nghiên cứu đã tạo đƣợc các huyền dịch vi khuẩn có nồng độ từ 107 vk/ µl đến 1vk/ µl và bộ bệnh phẩm DNA tinh khiết có nồng độ từ 107copy/ µl đến 1 copy/µl.
3.1.2. Lựa chọn các cặp mồi và tổ hợp mồi phù hợp:
Hình 3.1. Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 1 đến tổ hợp 8)
M: thang chuẩn DNA cỡ 100bp; TH: Tổ hợp mồi
Ở tất cả các tổ hợp mồi, các băng DNA đều hiện rõ ở vị trì 498 bp (tƣơng ứng với sản phẩm của cặp mồi Cps2J, đặc hiệu cho týp huyết thanh 2), và vị trì 248 bp (tƣơng ứng với sản phẩm của cặp mồi đặc hiệu cho enzym ly giải tế bào sly. Nhƣ vậy hai cặp mồi Cps2J và Sly đều hoạt động rất tốt trong cả 8 tổ hợp. Đối với các tổ hợp mồi từ 1 đến 4, các vạch DNA là sản phẩm của mồi đặc hiệu cho S.suis 16S
rDNA đều biểu hiện tốt.Tuy nhiên ở TH3 và TH4, cả 2 sản phẩm của cặp mồi Mrp có kìch thƣớc 188 bp đều không biểu hiện. Tất cả các tổ hợp từ 5 đến 8, sản phẩm của 2 cặp mồi Gdh và Cps2J biểu hiện không rõ ràng. Chỉ có TH1 và TH2, sản phẩm của tất cả các cặp mồi đều đƣợc biểu hiện, các vạch DNA phân tách rõ ràng, dễ quan sát. 500 200 100 M TH1 TH2 TH3 TH4 TH5 TH6 TH7 TH8 bp
Hình 3.2.Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 9 đến tổ hợp 16)
M: thang chuẩn DNA cỡ 100bp; TH: Tổ hợp mồi
Hính 3.2 cho thấy sản phẩm của các tổ hợp mồi từ 9 đến 12 đều đƣợc biểu hiện trên bản gel nhƣng những vạch này rất mờ; ở tổ hợp 15 và 16, các sản phẩm hiện rõ nét hơn. Tuy nhiên, kết quả điện di sản phẩm của các cặp mồi trên đều xuất hiện những vạch DNA không đặc hiệu. Ở tổ hợp 13 và 14, sản phẩm của các cặp mồi đều biểu hiện đầy đủ và rõ nét, hơn nữa không xuất hiện sản phẩm phụ trong kết quả điện di.
Nhƣ vậy, từ các thử nghiệm trên cho thấy trong 24 tổ hợp mồi, chỉ có tổ hợp mồi 1, 2, 13 và 14 là phù hợp và cho kết quả rõ ràng khi sử dụng để phát hiện S.suis bằng phƣơng pháp PCR đa mồi
Bảng 3.2. Các tổ hợp mồi thích hợp đƣợc lựa chọn trong thí nghiệm
Tổ hợp Loại mồi Đặc hiệu cho S. suis (KTSP : 294 bp) Typ huyết thanh 2 (KTSP: 498bp) Enzym ly giải tế bào (KTSP: 248 bp) Enzym khác (KTSP: 118 bp) Tổ hợp 1 16S rDNA Cps2J Sly - Tổ hợp 2 16S rDNA Cps2J Sly arcA Tổ hợp 13 16S rDNA Cps2JJ Sly - Tổ hợp 14 16S rDNA Cps2JJ Sly arcA
M TH9 TH10 TH11 TH12 TH13 TH14 TH15 TH16 300 500 200 100 bp
Những tổ hợp này thỏa mãn các yêu cầu cần thiết: thành phần có từ 3 đặc tình nhƣng ln phải có cặp mồi đặc hiệu chung cho vi khuẩn S. suis; kìch thƣớc sản phẩm PCR khác nhau để dễ phân biệt đƣợc; có cùng nhiệt độ bắt cặp; khả năng cạnh tranh thấp; đạt độ nhạy và đặc hiệu.
Trong 4 tổ hợp mồi đáp ứng yêu cầu, nhóm nghiên cứu lựa chọn tổ hợp 1 để thực hiện các bƣớc tối ƣu hóa tiếp theo để đảm bảo tình chình xác và giảm chi phì trong q trính thực nghiệm cũng nhƣ khi áp dụng vào thực tế.
3.1.3. Xác định điều kiện tối ƣu của phản ứng PCR đa mồi phát hiện S. suis và
một số yếu tố độc lực phổ biến
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của các chu trình PCR đến khả năng phát hiện S.suis Các điều kiện phản ứng đƣợc
thử nghiệm
Ảnh hƣởng tốt đến khả năng phát hiện của
PCR
Không tác động đến khả năng phát hiện của
phản ứng PCR
Thêm 1 bƣớc gia nhiệt phụ lúc
khởi đầu X
Tăng thời gian bắt cặp X Tăng số chu kỳ chình X
Tăng cả thời gian bắt cặp và số
chu kỳ chình X
Tăng thời gian kéo dài cuối cùng X Thay đổi nhiệt độ bắt cặp + lần
lƣợt những thay đổi trên X Thêm chu trính nhiệt phụ (gồm
đủ 3 bƣớc gia nhiệt) trƣớc khi vào chu trính nhiệt chình
X Thêm chu trính nhiệt phụ, thay
đổi thời gian kéo dài X Thêm chu trính nhiệt phụ, thay
đổi thời gian bắt cặp, tăng dần số chu kỳ chình
X Thêm chu trính nhiệt phụ, thay
đổi nhiệt độ biến tình, tăng số chu kỳ chình
Bảng 3.4. Khả năng phát hiện vi khuẩn và các yếu tố độc lực khi thay đổi điều kiện quy trình PCR đa mồi
Điều kiện của quy trình PCR đa mồi thay đổi Thêm 1 bƣớc gia nhiệt ban đầu Thêm 1 chu trình nhiệt phụ Thêm 1 chu trình nhiệt phụ + tăng số chu kỳ Thêm 1 chu trình nhiệt phụ + thay đổi nhiệt độ biến tình, tăng số chu kỳ chình Khả năng phát hiện vi khuẩn và một số yếu tố độc lực/ 1 ống pƣ ≥ 50 vi khuẩn
≥ 10 vi khuẩn ≥ 10 vi khuẩn ≥ 10 vi khuẩn
Sau q trính thử nghiệm, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn đƣợc chƣơng trính PCR có 2 chu trính nhiệt độ với nhiệt độ biến tình, thời gian biến tình và các chu kỳ thìch hợp trong từng chu trính nhiệt cũng nhƣ nhiệt độ bắt cặp và các khoảng thời gian thìch hợp trong mỗi bƣớc nhiệt. Khả năng phát hiện khi ứng dụng quy trính đạt ≥ 10 vi khuẩn (copy)/phản ứng.
Cụ thể:
- Thêm chu trính nhiệt phụ: có 3 chu kỳ của: 960C x 3 phút; 600C x 30 giây; 720C x 1 phút.
- Nhiệt độ bắt cặp thìch hợp, thời gian và số chu kỳ hợp lý trong chu trính chình: là chu trính nhiệt thứ hai với 40 chu kỳ của: 940C x 30 giây; 600C x 30 giây; 720C x 1 phút.
- Thời gian kéo dài sản phẩm ở giai đoạn nhiệt cuối cùng: 720C x 7 phút. Sản phẩm đìch rõ nét, khơng có hiện tƣợng cạnh tranh. Kết quả đƣợc minh họa ở hính 3.3
Hình 3.3. PCR đa mồi với các điều kiện phản ứng tối ƣu phát hiện trực tiếp S. suis trong bệnh phẩm
M: thang DNA chuẩn 100bp
Sp1: chủng vi khuẩn S. suis chuẩn (S. suis + TE) Sp2: Bệnh phẩm mô phỏng (DNT chứa S. suis đã chuẩn độ)
1: Sản phẩm PCR đại diện cho typ HT 2 2: Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu S. suis 3: Sản phẩm PCR đại diện enzym ly giải của
S.suis
3.1.4. Tối ƣu hóa các thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi phát hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến
Bảng 3.5. Thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi đƣợc khảo sát
Thành phần đƣợc thử nghiệm Ảnh hƣởng tốt
đến khả năng phát hiện của PCR
Không tác động đến khả năng phát hiện của phản ứng
PCR/ảnh hƣởng xấu Tăng hàm lƣợng Taq polymerase > 1,5u/pƣ X Giảm hàm lƣợng Taq polymerase < 1,5u/pƣ X Tăng hàm lƣợng dNTPs > 200µM X Giảm hàm lƣợng dNTPs < 200µM X
Tăng nồng độ MgCl2 > 1,5mM X Giảm nồng độ MgCl2 < 1,5mM X Tăng hàm lƣợng tất cả các mồi > 10 – 50 pmol /pƣ Không rõ ràng Giảm h/lƣợng tất cả các mồi < 10pmol/pƣ X Thay đổi nồng độ khác nhau
giữa các mồi
X Thay đôi “hàm lƣợng tế bào
đìch”: tăng thể tích bệnh phẩm
X Thay đơi “hàm lƣợng tế bào
đìch”: giảm thể tích mẫu, pha
lỗng bp
X
Bảng 3.5 cho thấy hàng lƣợng Taqpolymerase >1,5u/pƣ, hàm lƣợng dNTPs = 200 µM, nồng độ MgCl2 > 1,5mM, tỉ lệ các mồi và hàm lƣợng tế bào đìch phù hợp sẽ ảnh hƣởng tốt đến hiệu quả phát hiện S.suis của quy trính PCR đa mồi đƣợc xây dựng.
3.1.4.1. Tối ưu hóa nồng độ mồi tham gia phản ứng
Hình 3.4. Thử nghiệm hàm lƣợng các mồi với nồng độ mỗi mồi là 20pmol/µl
M: thang chuẩn DNA cỡ 100bp; C (-): chứng âm Nồng độ vi khuẩn từ 104vk/µl đến 10 vk/µl C(-) 104 103 10 2 10 M bp 100 0 300 500
Hính 3.4 cho thấy, ở nồng độ 104vk/µl và 103vk/µl, cả 3 sản phẩm DNA của 3 cặp mồi cps 2J, 16S rDNA và Sly đều biểu hiện, tuy nhiên vạch sản phẩm của cặp mồi cps 2J biểu hiện yếu hơn sản phẩm của 2 cặp mồi còn lại. Ở nồng độ 102 và 10 vk/µl, sản phẩm của cặp mồi cps 2J khơng biểu hiện, chỉ xuất hiện sản phẩm của 2 cặp mồi cịn lại. Điều này có thể do sức cạnh tranh của cặp mồi cps 2J yếu hơn khi hàm lƣợng DNA của vi khuẩn trong phản ứng ở nồng độ thấp. Ví vậy để khắc phục thực trạng này, chúng ta có thể giảm hàm lƣợng của 2 mồi mạnh 16S rDNA, Sly và tăng nồng độ của mồi cps2J.
Hình 3.5. Thử nghiệm hàm lƣợng mồi với nồng độ mồi khác nhau (cps2J = 40pmol/µl, Sly = 16S rDNA= 10pmol/µl)
M: thang chuẩn DNA cỡ 100bp;C (-): chứng âm Nồng độ vi khuẩn từ 103vk/µl đến 1vk/µl
Với nồng độ của các cặp mồi Sly, 16S rDNA và cps2J tƣơng ứng là 10, 10 và 40pmol/µl, cả 3 vạch sản phẩm DNA đều xuất hiện rõ nét ở tất cả các nồng độ vi khuẩn từ 103 đến 1 vk/µl. Nhƣ vậy, với nồng độ các mồi nhƣ trên thí độ nhạy của quy trính PCR đạt tới nồng độ 1 vi khuẩn/µl. Độ nhạy tăng đáng kể so với việc sử dụng mỗi cặp mồi với nồng độ 20pmol/µl (chỉ phát hiện đến 103vk/µl).
M 103 102 10 1 C (-)
500 300
100 bp
3.1.4.2. Tối ưu hóa hàm lượng DNA khn
Hình 3.6. Thử nghiệm Quy trình PCR đã xây dựng trên mẫu bệnh phẩm với các thể tích mẫu khác nhau
M: thang chuẩn DNA cỡ 100bp; DNA chuẩn: chứng dƣơng A2: 2µl mẫu A, B2: 2µl mẫu B, A1: 1µl mẫu A, B1: 1µl mẫu B
Kết quả điện di sản phẩm của 2 mẫu A2 và B2 chỉ xuất hiện 2 vạch DNA là sản phẩm của cặp mồi Sly (kìch thƣớc 248 bp) và 16S rDNA (kìch thƣớc 294 bp), mẫu A1 và B1 xuất hiện đầy đủ sản phẩm của cả 3 cặp mồi. Nhƣ vậy, việc sử dụng thể tìch mẫu ìt hơn (1µl) sẽ làm tăng khả năng biểu hiện của sản phẩm cũng nhƣ làm tăng hiệu quả của quy trính PCR đa mồi đƣợc xây dựng.
Sự phù hợp về nồng độ của gen đìch (hay luợng thể tìch bệnh phẩm) với hàm lƣợng các thành phần cơ bản của phản ứng cũng đóng vai trị quan trọng trong việc xác định các gen đìch đó. Q trính thử nghiệm của chúng tơi đã chứng minh sự ức chế q trính tạo sản phẩm PCR trong phản ứng PCR đa mồi là do thể tìch ‟khn DNA‟ lớn hơn yêu cầu gây nên. Trong những trƣờng hợp nghi ngờ, để tăng khả năng phát hiện tối đa vi khuẩn có mặt trong bệnh phẩm, chúng tơi đã phải giảm thể tìch khn đìch (pha lỗng bệnh phẩm và giảm thể tìch khn đìch) cùng với việc đảm bảo các điều kiện tối ƣu khác của PCR.
Nhƣ vậy quy trính PCR đa mồi tối ƣu đƣợc xây dựng nhƣ sau
M DNA chuẩn A2 B2 A1 B1
500 100 300 bp
Thành phần phản ứng:
- Taq polymerase: 2,5 đơn vị/1 phản ứng
- 200µM mỗi loại dNTP
- MgCl2: 2,5 - 3 mM/1 phản ứng
- Thành phần và nồng độ các cặp mồi
+ Mồi 16SrDNA: 10 pmol/phản ứng;
+ Mồi Sly (enzyme ly giải): 10pmol/phản ứng;
+ Mồi cps2J (typ huyết thanh 2): 40pmol/phản ứng;
- Thể tìch mẫu: 1µl.
Quy trình PCR:
- Thêm chu trính nhiệt phụ: có 3 chu kỳ của: 960C x 3 phút; 600C x 30 giây; 720C x 1 phút.
- Nhiệt độ bắt cặp thìch hợp, thời gian và số chu kỳ hợp lý trong chu trính chình: là chu trính nhiệt thứ hai với 40 chu kỳ của: 940C x 30 giây; 600C x 30 giây; 720
C x 1 phút.
- Thời gian kéo dài sản phẩm ở giai đoạn nhiệt cuối cùng: 720C x 7 phút.
3.1.5. Độ nhạy và tính ổn định của quy trình PCR đƣợc xây dựng (khả năng lặp lại kết quả)
Hình 3.7. Mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và 2 yếu tố độc lực của vi khuẩn bởi PCR đa mồi đã hồn thiện (kết quả với bệnh phẩm mơ phỏng)
M: Thang chuẩn DNA;
1 = băng DNA đặc hiệu của typ huyết thanh 2 2 = băng DNA đặc hiệu S. Suis
3= băng DNA đặc hiệu enzym ly giải.
100vk: 1 ống phản ứng chứa 100 vi khuẩn 10 vk: 1 ống phản ứng chứa 10 vi khuẩn 01 vk: 1 ống phản ứng chứa 1 vi khuẩn
Với quy trính PCR đã xây dựng hồn chỉnh, nhóm nghiên cứu đã thực hiện thử độ nhạy của quy trính trên các mẫu bệnh phẩm mô phỏng với các nồng độ từ 100 vk/phản ứng đến 01 vk/phản ứng. Kết quả cho thấy ở cả 3 nồng độ, tất cả các sản phẩm của 3 cặp mồi đều biểu hiện đầy đủ. Nhƣ vậy, mức độ phát hiện của quy trính đạt tới khoảng 01 vi khuẩn/phản ứng. So sánh với các quy trính đơn mồi và đa mồi đã đƣợc cơng bố thí kết quả của chúng tôi tƣơng tự (chắc chắn phát hiện đƣợc 10 vi khuẩn/phản ứng) hoặc cao hơn (có khả năng phát hiện đƣợc 1 vi khuẩn/1 ống phản ứng)
Bảng 3.6. Tính ổn định của Quy trình PCR khi thực hiện trên mẫu bệnh phẩm
Khả năng phát hiện
(số vk/pƣ)
Độ lặp lại của kỹ thuật (10 lần thử nghiệm) Số lần lặp lại (%) Số lần không lặp lại (%) 1 10/10 (100%) 0/10 (0%)
Ghi chú: Thử nghiệm áp dụng trên bệnh phẩm mô phỏng
PCR đa mồi 2 chu trính nhiệt độ
Taqpolymerase: 2.5u
MgCl2: 2.5mM
Tổ hợp mồi 1 với các hàm lƣợng khác nhau.
Nhóm nghiên cứu đã tiến hành lặp lại thử nghiệm 10 lần. Mức độ phát hiện của PCR đa mồi đã đạt ≥ 1 vi khuẩn / phản ứng. Phản ứng PCR đa mồi với các điều kiện và thành phần tham gia đã tối ƣu cho kết quả ổn định: luôn đạt ngƣỡng phát hiện ≥ 1 copy (vi khuẩn)/ 1 ống phản ứng ở cả 10 lần thử nghiệm (100%).
3.1.6. Đánh giá khả năng bắt cặp chéo của các cặp mồi (tính đặc hiệu) với những vi khuẩn phổ biến gây bệnh cảnh lâm sàng giống S. suis
Hình 3.8. Kiểm tra tính đặc hiệu của tổ hợp mồi & quy trình PCR đa mồi M: thang DNA chuẩn 100bp
C(+): chứng dƣơng (chủng chuẩn S. suis) thể hiện đủ 3 yếu tố của vi khuẩn. Spn: chứng âm (với S. pneumoniae, cùng họ với S. suis)
Spy: chứng âm (với S. pyogenes)
Nm: chứng âm (với N. meningitidis; gây bệnh cảnh giống S. suis). Hib: chủng vi khuẩn H. influenzae typ b gây bệnh VMN giống S. suis
Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm kiểm tra tình đặc hiệu của tổ hợp mồi và quy trính PCR đa mồi. Trong thử nghiệm này, chúng tôi đã sử dụng các chủng vi khuẩn là tác nhân cùng họ và gây bệnh cảnh giống S.suis bao gồm S. Pneumoniae, S. pyogenes, S. pyogenes và H. influenza, ngồi ra cịn sử dụng bạch cầu đơn nhân là loại tế bào chiếm số lƣợng lớn trong các mẫu bệnh phẩm. Kết quả thử nghiệm cho thấy chỉ có mẫu chứa tác nhân gây bệnh S.suis xuất hiện 3 vạch
DNA tƣơng ƣớng với sản phẩm của 3 cặp mồi đƣợc sử dụng. Ở các mẫu còn lại, khơng có mẫu nào xuất hiện sản phẩm của phản ứng PCR. Nhƣ vậy, quy trính PCR và tổ hợp mồi đƣợc xây dựng mang tình đặc hiệu cao, chỉ phát hiện S.suis mà không phát hiện đƣợc những loại vi khuẩn khác. Tình đặc hiệu của quy trính do nhiều yếu tố quyết định song trính tự các cặp mồi là yếu tố chủ yếu nhất. Ở đây, các cặp mồi là những trính tự đã đƣợc nghiên cứu và cơng bố đạt tình đặc hiệu cao (chỉ bắt cặp với trính tự đặc hiệu của vi khuẩn S. suis mà không bắt cặp với gen của những vi