CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
2.2.1. Nghiên cứu tạo bệnh phẩm mô phỏng
Tạo huyền dịch vi khuẩn thuần nhất, chuẩn bị DNA của vi khuẩn S. suis làm chứng dƣơng và tạo mơ hính thử nghiệm.
2.2.1.1. Khẳng định các đặc tính của vi khuẩn tạo mẫu:
Cấy mới
Cấy từ ống giữ chủng (cất ở -800C) lên môi trƣờng thạch máu 5%, ủ qua đêm ở 370C/5%CO2. Nhận xét hính thái khuẩn lạc, tình gây tan huyết.
Tính chất bắt màu Gram
Nhuộm Gram đƣợc thực hiện nhƣ sau:
- Làm sạch phiến kình bằng lau cồn và hơ qua lửa đèn cồn, để nguội;
- Lấy 1 khuẩn lạc, hòa đều khuẩn lạc vào trong giọt PBS (hoặc nƣớc muối sinh lý), dùng que cấy dàn rộng và để khô tự nhiên;
Chú ý: các bước này thực hiện trong tủ an toàn sinh học
- Cố định tế bào vi khuẩn trên phiến kình bằng hơ qua trên lửa đèn cồn hoặc bằng methanol;
- Phủ 1 giọt thuốc nhuộm Crystal Violet lên phần tiêu bản vi khuẩn, ngâm trong vòng 1 phút, rửa nƣớc;
- Phủ 1 giọt „Stabilized Gram Iodine‟ hoặc dung dịch 2% Iodide lên phần tiêu bản vi khuẩn, ngâm trong vòng 1 phút, rửa nƣớc;
- Để tẩy màu, ngâm tiêu bản vào dung dịch „Gram Decolorizer‟ (250ml Acetone + 750ml Isopropanol) hoặc dung dịch Acetone/Ethanol (50%/50%), sau đó rửa phiến kình bằng nƣớc máy;
- Phủ tiếp 1 giọt dung dịch „Gram Safranin Counterstain‟ hoặc dung dịch 0.1% Fucsin lên phần tiêu bản vi khuẩn, ngâm trong vòng 1 phút, rửa nƣớc;
- Tiêu bản đƣợc để khô tự nhiên. Trƣớc khi soi đặt một lá kình lên phần tiêu bản đã nhuộm và soi dƣới kinh hiển vi quang học có vật kình 100x .
Phản ứng catalase:
- Pha dung dịch 3% H2O2 với nƣớc cất trƣớc khi thực hiện phản ứng;
- Dùng que cấy lấy 1 khuẩn lạc vi khuẩn (thƣờng lấy ở tâm khuẩn lạc) đặt lên phiến kình. Khơng lấy lẫn thạch máu vào mẫu vi khuẩn;
- Nhỏ 1 giọt dung dịch H2O2 3% vào vùng có khuẩn lạc trên phiến kình;
- Quan sát sự nổi bong bóng (sinh khì);
Lưu ý: tồn bộ q trình thử nghiệm phải được thực hiện trong tủ an toàn sinh học
Xác định nhóm kháng nguyên theo Lancefield
- Cấy mới chủng vi khuẩn cần thử trên thạch máu cừu, ủ qua đêm ở 35-37oC có hoặc khơng có CO2;
- Pha enzym tách chiết (extraction enzyme solution): trộn 11ml nƣớc tinh khiết vào lọ enzym (Streptex), hoà tan. Dung dịch enzym này có thể giữ ở 2-8oC trong 3 tháng. Muốn giữ lâu hơn, chia nhỏ thể tìch và giữ ở -200C;
- Thực hiện phản ứng ngƣng kết tiếp theo trong tủ an tồn sinh học:
+ Nhỏ 1400 µl dung dịch enzym tách chiết (Extraction Enzyme solution) vào ống Epp đã đánh dấu (dung lƣợng 1,5ml). Hoà chủng vi khuẩn cần thử nghiệm vào dung dịch enzyme này (khoảng 5 khuẩn lạc to);
+ Ủ huyền dịch vi khuẩn/enzym ở 35- 37℃ trong 1 giờ;
+ Ly tâm ở 13000-15000 rpm trong 30‟‟(sec). Dịch nổi đƣợc thu hồi cho phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh xác định nhóm (dạng ngƣng kết latex);
+ Trộn kỹ các lọ thuốc thử latex bằng vortex. Nhỏ 01 giọt (khoảng 20µl của mỗi loại huyền dịch latex (Streptex) lên vịng tròn của tấm thẻ phản ứng;
+ Đặt 1 giọt (khoảng 10 µl huyền dịch vi khuẩn (sau bƣớc 3) vào thẻ phản ứng. Trộn đều và dàn rộng để quan sát hiện tƣợng ngƣng kết.
+ Xoay tấm thẻ lên xuống và quan sát phản ứng ngƣng kết bằng mắt thƣờng;
+ Ghi nhận kết quả: chủng S. suis đƣợc thử thuộc nhóm D.
Xác định tính chất sinh học
- Vi khuẩn S. suis đƣợc xác định tình chất sinh học bằng bộ API 20 Strep (BioMérieux);
- Tạo huyền dịch vi khuẩn có độ đục tƣơng đƣơng 1Mc Farland với nƣớc muối sinh lý;
- Nhỏ lên lam kình sạch 15µl kháng huyết thanh kháng S. suis typ 2;
- Nhỏ 15 µl nƣớc muối sinh lý lên 1 vị trì khác trên lam kình;
- Nhỏ vào mỗi vi trì trên 15µl huyền dịch vi khuẩn;
- Trộn đều bằng tăm gỗ, quan sát sự ngƣng kết trong vòng 1 phút:
+ Phản ứng (+): xuất hiện các hạt nhỏ và hỗn dịch trở nên trong ở vị trì có kháng huyết thanh; vẫn đục đều ở vị trì có nƣớc muối sinh lý;
2.2.1.2. Nghiên cứu tạo mơ hình bệnh phẩm với vi khuẩn S. suis:
- Chọn 10 mẫu DNT của những bệnh nhân viêm não vi rút hoặc hội chứng não cấp (đƣợc khẳng định không phải viêm màng não do vi khuẩn), hỗn hợp lại (đây là dịch não tủy nền)
- Gặt vi khuẩn S. suis (đã đƣợc cấy mới và kiểm tra ở trên) từ môi trƣờng
thạch máu 5% pha vào 1ml hỗn hợp dịch não tủy đã chuẩn bị ở trên.
- Điều chỉnh độ đục ngang với thang chuẩn 0,5 Mc Farland.Tình lại số vi khuẩn/ml (ví theo quy định của bộ so độ đục Mc Farland thí 1,5 x 108 tƣơng đƣơng độ đục 0,5 Mc Farland, thực tế đối với vi khuẩn S. suis sẽ là bao nhiêu ở độ đục 0,5 Mc Farland?) bằng cách pha loãng tiếp bậc 10, lấy 1ml ở nồng độ pha loãng thấp nhất (thƣờng tƣơng đƣơng 102/ml) láng đều lên đĩa thạch máu 5%, Ủ qua đêm và đếm số khuẩn lạc. Kết quả cho thấy số lƣợng vi khuẩn S. suis tƣơng đƣơng là 1,21 x 107 vk/ µl
- Từ canh khuẩn có độ đục 0,5 Mc Farland, sẽ thực hiện 2 việc:
+ Chia nhỏ thể tìch huyền dịch vi khuẩn vào các ống Eppendorf (0,1ml/1ống): để thực hiện mục đìch“Xây dựng phƣơng pháp xử lý dịch não tủy đơn giản không dùng kit và đảm bảo hiệu quả”
Pha các nồng độ vi khuẩn hơn kém nhau 10 lần như sau:
Hỗn dịch vi khuẩn có độ đục 0,5 Mc Farland có lƣợng vi khuẩn tƣơng đƣơng 107 vk/µl (1). Để có nồng độ 106vk/ µl: 10 µl của (1) + 90 µl DNT (2) Để có nồng độ 105 vk/ µl: lấy 10 µl của (2) + 90 µl DNT (3) Để có nồng độ 104 vk/ µl: lấy 10 µl của (3) + 90 µl DNT (4) Để có nồng độ 103vk/ µl: lấy 10 µl của (4) + 90 µl DNT (5) Để có nồng độ 102vk/ µl: lấy 10 µl của (5) + 90 µl DNT (6) Để có nồng độ 10vk/ µl: lấy 10 µl của (6) + 90 µl DNT (7) Để có nồng độ 1vk/ µl: lấy 10 µl của (7) + 90 µl DNT (8) Để có nồng độ 5 vk/ µl: lấy 10 µl của (7) + 10 µl DNT (9) Để có nồng độ 2 vk/ µl: lấy 10 µl của (7) + 40 µl DNT (10)
Những nồng độ vi khuẩn còn nguyên vẹn này được sử dụng để nghiên cứu xây dựng, tối ưu quy trình PCR đa mồi và kỹ thuật tách chiết DNA đơn giản bằng nhiệt độ, không sử dụng kit tách chiết (là thương phẩm) và đánh giá kết quả phát hiện trực tiếp vi khuẩn từ DNT bằng PCR.
+ Sử dụng 0,5ml hỗn dịch để tách DNA bằng bộ sinh phẩm „High Pure PCR product purification‟ và enzyme mutanolysin. Sau đó đo lƣợng DNA thu đƣợc bằng máy đo “DNA Nano drop” và pha thành các nồng độ nhỏ hơn nhau 10 lần (pha loãng bậc 10) với dịch não tủy nền: loạt nồng độ này sử dụng để xác định giới hạn phát hiện (độ nhạy) của quy trính PCR đa mồi.
Chi tiết của bước ‘Tách chiết và tinh sạch DNA của vi khuẩn S. suis – đo nồng độ DNA':
- Từ chủng vi khuẩn S. suis gây bệnh đã qua các bƣớc kiểm tra chất lƣợng ở trên đƣợc cấy mới trên môi trƣờng thạch máu 5%.
- Chuẩn độ vi khuẩn theo độ đục 0,5 Mc Farland (trong DNT).
- Lấy 0,5ml hỗn dịch vi khuẩn có độ đục trên, ly tâm 14.500 vòng/15 phút, lấy cặn bỏ dịch nổi.
- Ủ cặn với 90µl đệm Tris (10mM, pH 8,0) và 10 µl Mutanolysin (1mg/ml) ở 370C/20 phút.
- Sau đó thực hiện theo hƣớng dẫn của Nhà sản xuất Roche “High Pure PCR product purification Kit” (Roche Diagnostics, Cat. 11732676001).
- Trộn 500 µl Binding Buffer với hỗn dịch (4), đặt hỗn hợp vào ống lọc (Filter) đƣợc hứng phìa dƣới bởi 1 ống dung tìch 2ml, ly tâm 14500 x 45 sec (yêu cầu 15000 vòng x 30sec) ở máy ly tâm Mini plus.
- Chuyển ống Filter sang ống 2ml mới, cho tiếp 500 µl Washing Buffer vào Filter (loại bỏ ống cũ đã chứa dịch ly tâm), ly tâm 14500 vòng x 45 sec (yêu cầu 15000 vòng x 30sec) ở máy ly tâm Mini plus.
- Chuyển ống Filter sang ống 2ml mới, cho tiếp 200 µl Washing Buffer vào Filter (loại bỏ ống cũ đã chứa dịch ly tâm), ly tâm 14500 vòng x 45 sec (yêu cầu 15000 vòng x 30sec) ở máy ly tâm Mini plus.
- Chuyển ống Filter sang ống Eppendorf 1,5ml mới, viết tên/mã số bệnh phẩm lên nắp (loại bỏ ống cũ đã chứa dịch ly tâm), cho 50 µl Tris buffer (10mM, pH 8.0) vào ống Filter, đóng chặt nắp và đặt cả bộ vào máy Ủ NHIỆT 700C/10 phút. Sau khi “ủ nhiệt” ly tâm 14500 vòng x 45 sec (yêu cầu 15000 vòng x 30sec) ở máy ly tâm Mini plus.
- Loại bỏ ống Filter, giữ lại ống Epp đã chứa dịch đƣợc đẩy xuống (đó là DNA đã đƣợc tách chiết & tinh sạch). Bảo quản ở - 200C và sử dụng 0,5 - 1 µl làm khn đìch DNA
- Đo nồng độ DNA đã tinh sạch bằng máy quang phổ đo DNA. Tình số lƣợng vi khuẩn dựa trên trọng lƣợng phân tử (DNA) của vi khuẩn.
Cách tính: hàm lƣợng DNA của vi khuẩn trong huyền dịch vi khuẩn thuần nhất sau khi tách chiết bằng Kit (bộ sinh phẩm thƣơng mại):
46.71 µg/ml (= 4,67 x 10-8g/µl). Kìch thƣớc bộ gen của S. suis là: 2Mb = 2 x 106
(bp) Trọng lƣợng phân tử là: 2 x 106 x 660 = 1,32 x 109 dalton
Ví vậy, số copy (hay số vi khuẩn) trong 1µl của huyền dịch tạo đƣợc là: (4,67 x 10-8 x 6,023 x 1023 ) x 1
---------------------------------------- = 2,13 x 107 copy/µl (1)
1,32 x 109
+ Để có nồng độ 106
copy / µl: lấy 10 µl của (1) + 90 µl DNT (2)
+ Để có nồng độ 105 copy / µl: lấy 10 µl của (2) + 90 µl DNT (3)
+ Để có nồng độ 104 copy / µl: lấy 10 µl của (3) + 90 µl DNT (4)
+ Để có nồng độ 103 copy / µl: lấy 10 µl của (4) + 90 µl DNT (5)
+ Để có nồng độ 102 copy /µl: lấy 10 µl của (5) + 90 µl DNT (6)
+ Để có nồng độ 101 copy / µl: lấy 10 µl của (6) + 90 µl DNT (7)
+ Để có nồng độ 100(1 copy)/µl: lấy 10 µl của (7) + 90 µl DNT (8)
+ Để có nồng độ 5 copy/µl: lấy 10 µl của (7) + 10 µl DNT (9)
+ Để có nồng độ 2 copy /µl: lấy 10 µl của (7) + 40 µl DNT (10)
Những nồng độ DNA này được sử dụng trong thực nghiệm đánh giá hiệu quả phát hiện của PCR đa mồi:
2.2.2. Nghiên cứu lựa chọn tổ hợp mồi đại diện cho S. suis và một số yếu tố chủ yếu liên quan đến độc lực của vi khuẩn yếu liên quan đến độc lực của vi khuẩn
Yêu cầu về tổ hợp mồi:
- Thành phần của tổ hợp mồi có thể có ìt nhất 3 cặp mồi của 3 gen khác nhau ln phải có cặp mồi đặc hiệu chung cho vi khuẩn S. suis
- Kìch thƣớc sản phẩm PCR khác nhau để có thể phân biệt đƣợc
- Có cùng nhiệt độ bắt cặp
- Khả năng cạnh tranh thấp
- Đạt độ nhạy và đặc hiệu
Thực hiện theo yêu cầu trên, cụ thể trong nghiên cứu này, mỗi tổ hợp mồi bao gồm 1 cặp đặc hiệu cho S. suis + 1 cặp đặc hiệu cho typ huyết thanh 2 + 1 cặp đặc hiệu cho Suilysin/ hoặc 1,2 yếu tố độc lực phổ biến khác.
Bảng 2.2. Các tổ hợp mồi đƣợc sử dụng trong thử nghiệm
Tổ hợp Các loại mồi Đặc hiệu cho S. suis Typ huyết thanh 2 Enzym ly giải tế bào Enzym khác Protein ngoại bào Tổ hợp 1 16S rDNA Cps2J Sly - - Tổ hợp 2 16S rDNA Cps2J Sly arcA - Tổ hợp 3 16S rDNA Cps2J Sly - Mrp Tổ hợp 4 16SrDNA Cps2J Sly arcA Mrp Tổ hợp 5 Gdh Cps2J Sly - - Tổ hợp 6 Gdh Cps2J Sly arcA - Tổ hợp 7 Gdh Cps2J Sly - Mrp Tổ hợp 8 Gdh Cps2J Sly arcA Mrp Tổ hợp 9 Strep2 Cps2J Sly - - Tổ hợp 10 Strep2 Cps2J Sly arcA - Tổ hợp 11 Strep2 Cps2J Sly - Mrp Tổ hợp 12 Strep2 Cps2J Sly arcA mrp Tổ hợp 13 16S rDNA Cps2JJ Sly - - Tổ hợp 14 16S rDNA Cps2JJ Sly arcA -
Tổ hợp 15 16S rDNA Cps2JJ Sly - Mrp Tổ hợp 16 16SrDNA Cps2JJ Sly arcA Mrp Tổ hợp 17 Gdh Cps2JJ Sly - - Tổ hợp 18 Gdh Cps2JJ Sly arcA - Tổ hợp 19 Gdh Cps2JJ Sly - Mrp Tổ hợp 20 Gdh Cps2JJ Sly arcA Mrp Tổ hợp 21 Strep2 Cps2JJ Sly - - Tổ hợp 22 Strep2 Cps2JJ Sly arcA - Tổ hợp 23 Strep2 Cps2JJ Sly - Mrp Tổ hợp 24 Strep2 Cps2JJ Sly arcA Mrp
Kỹ thuật sử dụng để đánh giá:
- Kỹ thuật PCR thông thƣờng (đơn mồi và đa mồi đƣợc xây dựng trong đề tài)
- Kỹ thuật điện di
+ Sử dụng thạch điện di Nusieve GTG Agarose và „Seakem GTG Agarose‟ pha tỷ lệ 1/1 (2%) ; 1,5/1 (2,5%) và 2/1 (3%) trong đệm điện di (TAE hoặc TBE).
+ Pha mẫu điện di : 2µl Loading buffer + 8µl sản phẩm PCR (1 giếng)
+ Chạy điện di ở điện thế 100V /30 phút.
+ Nhuộm sản phẩm điện di bằng Red Safe.
2.2.3. Nghiên cứu tối ƣu chu trình nhiệt
Thực nghiệm thay đổi các điều kiện về nhiệt độ biến tình, thời gian biến tình, nhiệt độ bắt cặp, thời gian bắt cặp, thời gian kéo dài, số chu kỳ, bổ sung thêm chu trính nhiệt phụ... để chọn ra chƣơng trính PCR đa mồi thìch hợp với mục tiêu “phát hiện S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến”
Kỹ thuật sử dụng trong suốt nghiên cứu là PCR với các chƣơng trính nhiệt thay đổi để lựa chọn những điều kiện cho hiệu quả cao nhất.
Bảng 2..3. Các chu trình PCR đa mồi đƣợc thử nghiệm
TT Giai đoạn đầu Giai đoạn chính Giai đoạn
sau cùng
Ghi chú
1 960C (3‟) 940C (30”); 550C (30”); 720C (1‟);35 chu kỳ
720C (5‟) Thêm giai đoạn nhiệt độ cao lúc khởi đầu 2 960C (3‟) 940C (30”);550 C (30”); 720C (1‟)40 chu kỳ 720C (5‟) CT1+Tăng số chu kỳ chình 3 960C (3‟) 940C (30”);550C (30”); 720C (1‟); 35 chu kỳ
720C (5‟) CT1+Tăng thời gian bắt cặp
4 960C (3‟) 940C (30”);550C (60”); 720C (1‟); 40 chu kỳ
720C (5‟) CT1+Tăng số chu kỳ chình + Tăng thời gian bắt cặp
5 960C (3‟) 940C (30”); 550C (30”); 720C (1‟);35 chu kỳ
720C (10’) CT1 + Tăng thời gian kéo dài cuối cùng 6 960C (3‟) 940C (30”); 600 C (30”); 720C (1‟);35 chu kỳ 720C (5‟) CT1 + tăng nhiệt độ bắt cặp 7 960C (3‟) 940C (30”); 600 C (30”); 720C (1‟)40 chu kỳ 720C (5‟) CT2 + tăng nhiệt độ bắt cặp 8 960C (3‟) 940C (30”); 600C (30”); 720C (1‟); 35 chu kỳ 720C (5‟) CT3 + tăng nhiệt độ bắt cặp 9 960C (3‟) 940C (30”); 600C (60”); 720C (1‟); 40 chu kỳ 720C (5‟) CT4 + tăng nhiệt độ bắt cặp 10 960C (3‟) 940C (30”); 600 C (30”); 720C (1‟);35 chu kỳ 720C (10’) CT5 + tăng nhiệt độ bắt cặp 11 950C (3‟); 600C (30”); 720C (1‟), 3 chu kỳ 940C (30”); 600 C (30”); 720C (1‟);35 chu kỳ 720C (5‟) CT phụ + CK8 12 950C (3‟); 600C (60”); 720C (1‟), 3 chu kỳ 940C (30”); 600 C (30”); 720C (1‟);35 chu kỳ
720C (5‟) CT11+Tăng thời gian bắt cặp của chu trính phụ 13 950C (3‟); 600C (60”); 720C (1‟), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (60”); 720C (1‟);35 chu kỳ
720C (5‟) CT12+ Tăng thời gian bắt cặp của chu trính chình 14 950C (3‟); 600C (60”); 720C (1‟), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (60”); 720C (1‟);40 chu kỳ
720C (5‟) CT 13 + Tăng thêm chu kỳ chình
15 950C (3‟); 600C
(60”); 720C (1‟), 3 chu kỳ
940C (30”); 600C (60”);
720C (1‟);40 chu kỳ
720C (7’) CT14 + Tăng thời gian kéo dài cuối cùng 16 960C (3‟); 600C (60”); 720C (1‟), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (60”); 720C (1‟);40 chu kỳ 720C (7’) CT15 + Tăng nhiệt độ chu trính phụ 17 960C (3‟); 600C (30”); 720C (1‟), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (30”); 720C (1‟);40 chu kỳ
720C (7’) CT16 + Giảm thời gian bắt cặp
2.2.4. Nghiên cứu tối ƣu các thành phần tham gia phản ứng
Thực nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của hàm lƣợng các chất tham gia phản ứng và một số chất có thể gây ức chế phản ứng PCR có mặt trong mẫu bệnh phẩm dịch não tủy (các dNTP, Taq polymerase, muối MgCl2, NaCl, chất xử lý nhày...): thay
đổi hàm lƣợng, đánh giá bằng PCR đa mồi đã đƣợc tối ƣu điều kiện ở trên.
Lựa chọn thạch điện di và nồng độ thạch điện di để đảm bảo phát hiện sản phẩm PCR đa mồi.
2.2.5. Nghiên cứu mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực
của vi khuẩn bởi quy trình PCR đa mồi đƣợc xây dựng trong nghiên cứu. Tính ổn định của PCR đa mồi.
- Sử dụng bệnh phẩm mô phỏng chứa DNA đã tinh chế của vi khuẩn ở một dải nồng độ từ 106 đến 1 copy/µl (là sản phẩm của 2. 2. 1)
- Sử dụng tổ hợp mồi (là sản phẩm của 2.2. 2)
- Sử dụng chƣơng trính PCR đa mồi đƣợc xây dựng (là sản phẩm của 2. 2. 3)
- Sử dụng các thành phần tham gia phản ứng PCR ở mức độ tối ƣu ((là sản