Thành phần đƣợc thử nghiệm Ảnh hƣởng tốt
đến khả năng phát hiện của PCR
Không tác động đến khả năng phát hiện của phản ứng
PCR/ảnh hƣởng xấu Tăng hàm lƣợng Taq polymerase > 1,5u/pƣ X Giảm hàm lƣợng Taq polymerase < 1,5u/pƣ X Tăng hàm lƣợng dNTPs > 200µM X Giảm hàm lƣợng dNTPs < 200µM X
Tăng nồng độ MgCl2 > 1,5mM X Giảm nồng độ MgCl2 < 1,5mM X Tăng hàm lƣợng tất cả các mồi > 10 – 50 pmol /pƣ Không rõ ràng Giảm h/lƣợng tất cả các mồi < 10pmol/pƣ X Thay đổi nồng độ khác nhau
giữa các mồi
X Thay đơi “hàm lƣợng tế bào
đìch”: tăng thể tích bệnh phẩm
X Thay đôi “hàm lƣợng tế bào
đìch”: giảm thể tích mẫu, pha
lỗng bp
X
Bảng 3.5 cho thấy hàng lƣợng Taqpolymerase >1,5u/pƣ, hàm lƣợng dNTPs = 200 µM, nồng độ MgCl2 > 1,5mM, tỉ lệ các mồi và hàm lƣợng tế bào đìch phù hợp sẽ ảnh hƣởng tốt đến hiệu quả phát hiện S.suis của quy trính PCR đa mồi đƣợc xây dựng.
3.1.4.1. Tối ưu hóa nồng độ mồi tham gia phản ứng
Hình 3.4. Thử nghiệm hàm lƣợng các mồi với nồng độ mỗi mồi là 20pmol/µl
M: thang chuẩn DNA cỡ 100bp; C (-): chứng âm Nồng độ vi khuẩn từ 104vk/µl đến 10 vk/µl C(-) 104 103 10 2 10 M bp 100 0 300 500
Hính 3.4 cho thấy, ở nồng độ 104vk/µl và 103vk/µl, cả 3 sản phẩm DNA của 3 cặp mồi cps 2J, 16S rDNA và Sly đều biểu hiện, tuy nhiên vạch sản phẩm của cặp mồi cps 2J biểu hiện yếu hơn sản phẩm của 2 cặp mồi còn lại. Ở nồng độ 102 và 10 vk/µl, sản phẩm của cặp mồi cps 2J khơng biểu hiện, chỉ xuất hiện sản phẩm của 2 cặp mồi cịn lại. Điều này có thể do sức cạnh tranh của cặp mồi cps 2J yếu hơn khi hàm lƣợng DNA của vi khuẩn trong phản ứng ở nồng độ thấp. Ví vậy để khắc phục thực trạng này, chúng ta có thể giảm hàm lƣợng của 2 mồi mạnh 16S rDNA, Sly và tăng nồng độ của mồi cps2J.
Hình 3.5. Thử nghiệm hàm lƣợng mồi với nồng độ mồi khác nhau (cps2J = 40pmol/µl, Sly = 16S rDNA= 10pmol/µl)
M: thang chuẩn DNA cỡ 100bp;C (-): chứng âm Nồng độ vi khuẩn từ 103vk/µl đến 1vk/µl
Với nồng độ của các cặp mồi Sly, 16S rDNA và cps2J tƣơng ứng là 10, 10 và 40pmol/µl, cả 3 vạch sản phẩm DNA đều xuất hiện rõ nét ở tất cả các nồng độ vi khuẩn từ 103 đến 1 vk/µl. Nhƣ vậy, với nồng độ các mồi nhƣ trên thí độ nhạy của quy trính PCR đạt tới nồng độ 1 vi khuẩn/µl. Độ nhạy tăng đáng kể so với việc sử dụng mỗi cặp mồi với nồng độ 20pmol/µl (chỉ phát hiện đến 103vk/µl).
M 103 102 10 1 C (-)
500 300
100 bp
3.1.4.2. Tối ưu hóa hàm lượng DNA khn
Hình 3.6. Thử nghiệm Quy trình PCR đã xây dựng trên mẫu bệnh phẩm với các thể tích mẫu khác nhau
M: thang chuẩn DNA cỡ 100bp; DNA chuẩn: chứng dƣơng A2: 2µl mẫu A, B2: 2µl mẫu B, A1: 1µl mẫu A, B1: 1µl mẫu B
Kết quả điện di sản phẩm của 2 mẫu A2 và B2 chỉ xuất hiện 2 vạch DNA là sản phẩm của cặp mồi Sly (kìch thƣớc 248 bp) và 16S rDNA (kìch thƣớc 294 bp), mẫu A1 và B1 xuất hiện đầy đủ sản phẩm của cả 3 cặp mồi. Nhƣ vậy, việc sử dụng thể tìch mẫu ìt hơn (1µl) sẽ làm tăng khả năng biểu hiện của sản phẩm cũng nhƣ làm tăng hiệu quả của quy trính PCR đa mồi đƣợc xây dựng.
Sự phù hợp về nồng độ của gen đìch (hay luợng thể tìch bệnh phẩm) với hàm lƣợng các thành phần cơ bản của phản ứng cũng đóng vai trị quan trọng trong việc xác định các gen đìch đó. Q trính thử nghiệm của chúng tôi đã chứng minh sự ức chế quá trính tạo sản phẩm PCR trong phản ứng PCR đa mồi là do thể tìch ‟khn DNA‟ lớn hơn yêu cầu gây nên. Trong những trƣờng hợp nghi ngờ, để tăng khả năng phát hiện tối đa vi khuẩn có mặt trong bệnh phẩm, chúng tơi đã phải giảm thể tìch khn đìch (pha lỗng bệnh phẩm và giảm thể tìch khn đìch) cùng với việc đảm bảo các điều kiện tối ƣu khác của PCR.
Nhƣ vậy quy trính PCR đa mồi tối ƣu đƣợc xây dựng nhƣ sau
M DNA chuẩn A2 B2 A1 B1
500 100 300 bp
Thành phần phản ứng:
- Taq polymerase: 2,5 đơn vị/1 phản ứng
- 200µM mỗi loại dNTP
- MgCl2: 2,5 - 3 mM/1 phản ứng
- Thành phần và nồng độ các cặp mồi
+ Mồi 16SrDNA: 10 pmol/phản ứng;
+ Mồi Sly (enzyme ly giải): 10pmol/phản ứng;
+ Mồi cps2J (typ huyết thanh 2): 40pmol/phản ứng;
- Thể tìch mẫu: 1µl.
Quy trình PCR:
- Thêm chu trính nhiệt phụ: có 3 chu kỳ của: 960C x 3 phút; 600C x 30 giây; 720C x 1 phút.
- Nhiệt độ bắt cặp thìch hợp, thời gian và số chu kỳ hợp lý trong chu trính chình: là chu trính nhiệt thứ hai với 40 chu kỳ của: 940C x 30 giây; 600C x 30 giây; 720
C x 1 phút.
- Thời gian kéo dài sản phẩm ở giai đoạn nhiệt cuối cùng: 720C x 7 phút.
3.1.5. Độ nhạy và tính ổn định của quy trình PCR đƣợc xây dựng (khả năng lặp lại kết quả)
Hình 3.7. Mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và 2 yếu tố độc lực của vi khuẩn bởi PCR đa mồi đã hồn thiện (kết quả với bệnh phẩm mơ phỏng)
M: Thang chuẩn DNA;
1 = băng DNA đặc hiệu của typ huyết thanh 2 2 = băng DNA đặc hiệu S. Suis
3= băng DNA đặc hiệu enzym ly giải.
100vk: 1 ống phản ứng chứa 100 vi khuẩn 10 vk: 1 ống phản ứng chứa 10 vi khuẩn 01 vk: 1 ống phản ứng chứa 1 vi khuẩn
Với quy trính PCR đã xây dựng hồn chỉnh, nhóm nghiên cứu đã thực hiện thử độ nhạy của quy trính trên các mẫu bệnh phẩm mô phỏng với các nồng độ từ 100 vk/phản ứng đến 01 vk/phản ứng. Kết quả cho thấy ở cả 3 nồng độ, tất cả các sản phẩm của 3 cặp mồi đều biểu hiện đầy đủ. Nhƣ vậy, mức độ phát hiện của quy trính đạt tới khoảng 01 vi khuẩn/phản ứng. So sánh với các quy trính đơn mồi và đa mồi đã đƣợc cơng bố thí kết quả của chúng tôi tƣơng tự (chắc chắn phát hiện đƣợc 10 vi khuẩn/phản ứng) hoặc cao hơn (có khả năng phát hiện đƣợc 1 vi khuẩn/1 ống phản ứng)
Bảng 3.6. Tính ổn định của Quy trình PCR khi thực hiện trên mẫu bệnh phẩm
Khả năng phát hiện
(số vk/pƣ)
Độ lặp lại của kỹ thuật (10 lần thử nghiệm) Số lần lặp lại (%) Số lần không lặp lại (%) 1 10/10 (100%) 0/10 (0%)
Ghi chú: Thử nghiệm áp dụng trên bệnh phẩm mô phỏng
PCR đa mồi 2 chu trính nhiệt độ
Taqpolymerase: 2.5u
MgCl2: 2.5mM
Tổ hợp mồi 1 với các hàm lƣợng khác nhau.
Nhóm nghiên cứu đã tiến hành lặp lại thử nghiệm 10 lần. Mức độ phát hiện của PCR đa mồi đã đạt ≥ 1 vi khuẩn / phản ứng. Phản ứng PCR đa mồi với các điều kiện và thành phần tham gia đã tối ƣu cho kết quả ổn định: luôn đạt ngƣỡng phát hiện ≥ 1 copy (vi khuẩn)/ 1 ống phản ứng ở cả 10 lần thử nghiệm (100%).
3.1.6. Đánh giá khả năng bắt cặp chéo của các cặp mồi (tính đặc hiệu) với những vi khuẩn phổ biến gây bệnh cảnh lâm sàng giống S. suis
Hình 3.8. Kiểm tra tính đặc hiệu của tổ hợp mồi & quy trình PCR đa mồi M: thang DNA chuẩn 100bp
C(+): chứng dƣơng (chủng chuẩn S. suis) thể hiện đủ 3 yếu tố của vi khuẩn. Spn: chứng âm (với S. pneumoniae, cùng họ với S. suis)
Spy: chứng âm (với S. pyogenes)
Nm: chứng âm (với N. meningitidis; gây bệnh cảnh giống S. suis). Hib: chủng vi khuẩn H. influenzae typ b gây bệnh VMN giống S. suis
Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm kiểm tra tình đặc hiệu của tổ hợp mồi và quy trính PCR đa mồi. Trong thử nghiệm này, chúng tôi đã sử dụng các chủng vi khuẩn là tác nhân cùng họ và gây bệnh cảnh giống S.suis bao gồm S. Pneumoniae, S. pyogenes, S. pyogenes và H. influenza, ngoài ra còn sử dụng bạch cầu đơn nhân là loại tế bào chiếm số lƣợng lớn trong các mẫu bệnh phẩm. Kết quả thử nghiệm cho thấy chỉ có mẫu chứa tác nhân gây bệnh S.suis xuất hiện 3 vạch
DNA tƣơng ƣớng với sản phẩm của 3 cặp mồi đƣợc sử dụng. Ở các mẫu cịn lại, khơng có mẫu nào xuất hiện sản phẩm của phản ứng PCR. Nhƣ vậy, quy trính PCR và tổ hợp mồi đƣợc xây dựng mang tình đặc hiệu cao, chỉ phát hiện S.suis mà không phát hiện đƣợc những loại vi khuẩn khác. Tình đặc hiệu của quy trính do nhiều yếu tố quyết định song trính tự các cặp mồi là yếu tố chủ yếu nhất. Ở đây, các cặp mồi là những trính tự đã đƣợc nghiên cứu và cơng bố đạt tình đặc hiệu cao (chỉ bắt cặp với trính tự đặc hiệu của vi khuẩn S. suis mà không bắt cặp với gen của những vi
khuẩn khác). 500 300
3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ BỆNH PHẨM ĐƠN GIẢN, DỄ THỰC HIỆN ĐỂ BỘC LỘ DNA CỦA VI KHUẨN Streptococcus suis ĐẠT HIỆU QUẢ
(ĐÁNH GIÁ BẰNG KẾT QUẢ PHÁT HIỆN CỦA PCR ĐA MỒI)
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của các phƣơng pháp xử lý bệnh phẩm dùng/không dùng kit
TT Phƣơng pháp xử lý Hiệu quả phát hiện vi khuẩn
(bằng PCR đa mồi đƣợc hoàn thiện bởi đề tài)
104 vk 102 vk 50 vk 10 vk 1 vk
1 Enzym + kit (Roche)
(mutanolysin) + + + - - 2 Enzyme + nhiệt độ (lysozyme +1000C/10‟) + - - - - 3 Enzyme + nhiệt độ (mutanolysin + 1000C/10‟) + + + - - 4 Nhiệt độ từ 85 – 1000C và
thay đổi thời gian ủ (10’;15’;20’;35’..)
- - - - -
5 Nhiệt độ 800C và thay đổi
thời gian:
800C/35’; 75’; 90’
- - - - -
6 Nhiệt độ 800C /60’ + + + + +
Hiệu quả phát hiện vi khuẩn đƣợc đánh giá bằng PCR đơn mồi và đa mồi, số vi khuẩn đƣợc phát hiện là số vi khuẩn có trong 1 ống phản ứng.
Kết quả khảo sát ở Bảng 3.7 cho thấy để xử lý bệnh phẩm nhằm tách chiết DNA của vi khuẩn S. suis, biện pháp kết hợp „Kit + enzym mutanolysin‟ cho phép
phát hiện khi nồng độ vi khuẩn ở từ 50 - 104
vi khuẩn/pƣ (107vk/ml), tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp xử lý mẫu bệnh phẩm bằng „enzyme mutanolysin và nhiệt độ 1000C. Điều này có thể là do khi xử lý bằng kit có thể DNA đã bị mất đi trong quá trính tách chiết nên quy trính PCR kết hợp với xử lý bệnh phẩm bằng kit chỉ phát hiện đƣợc số lƣợng vi khuẩn ở nồng độ tƣơng đối cao. Tuy nhiên việc xử lý mẫu bệnh phẩm bằng lyzozym ở 1000C chỉ có hiệu quả khi số lƣợng vi khuẩn ở nồng độ 104 vk/pƣ.
Kết quả của việc xử lý mẫu bệnh phẩm bằng nhiệt độ đơn thuần, không sử dụng enzyme đƣợc minh họa nhƣ các hính dƣới đây
Hình 3.9. Xử lý mẫu bệnh phẩm dịch não tủy ở nhiệt độ 850C và 900
C trong 60 phút
M: thang chuẩn DNA 100bp; Kit 107 : vi khuẩn chuẩn đƣợc xử lý bằng bộ sinh phẩm tách chiết DNA và sử
dụng nhƣ chứng dƣơng;
T1.107 đến T1.104: vi khuẩn chuẩn ở 4 nồng độ khác nhau và đƣợc xử lý ở nhiệt độ 850C trong 60 phút
T2.107 đến T2. 104: vi khuẩn chuẩn ở 4 nồng độ khác nhau và đƣợc xử lý ở nhiệt độ 900C trong 60 phút
Để đảm bảo tình tiết kiệm, nhóm nghiên cứu đã sử dụng quy trính PCR đơn mồi phát hiện typ huyết thanh 2 đã đƣợc xây dựng trong nghiên cứu trƣớc đây để tiến hành thử nghiệm trên. Hính 3.9 cho thấy, khi xử lý mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ 850C hoặc 900C trong 60 phút thí chỉ thấy vạch DNA đìch xuất hiện ở nồng độ 107
và 106vk/pƣ, cịn ở nồng độ 105 và 104 vk/pƣ, không thấy xuất hiện vạch DNA. Nhƣ vậy khi xử lý bệnh phẩm ở các nhiệt độ trên chỉ phát hiện đƣợc vi khuẩn đến nồng độ 106vk/pƣ.
M K107 T1.107 T1.106 T1.105 T1.104 T2.107 T2.106 T2.105 T2.104
Hình 3.10. Hiệu quả xử lý dịch não tủy ở nhiệt độ 800C với thời gian ủ khác nhau
M: thang chuẩn DNA; (+): chứng dƣơng
T1.1-T1.3: xử lý ở 800C trong 35 phút với các nồng độ vk từ 106 đến 104 T2.1 – T2.3: xử lý ở 800C trong 75 phút với các nồng độ vk từ 106 đến 104 T3.1 – T3.3: xử lý ở 800C trong 90 phút với các nồng độ vk từ 106 đến 104
Hính 3.10 cho thấy, khi xử lý bệnh phẩm ở 800C trong 35, 75 và 90 phút, ở tất cả các nồng độ vi khuẩn từ 106 đến 104
vk/pƣ đều không thấy xuất hiện vạch DNA đìch. Nhƣ vậy phƣơng pháp xử lý bệnh phẩm dịch não tủy ở điều kiện 800
C trong 35, 75 và 90 phút không đạt hiệu quả.
Hình 3.11. Hiệu quả xử lý dịch não tủy bằng Kit và bằng nhiệt độ 800C/60’
(đánh giá bởi PCR đa mồi)
M: thang chuẩn DNA; (+): chứng dƣơng 106,105,…5, 2, 1: Số lƣợng vk/pƣ K: Xử lý mẫu bệnh phẩm bằng kit T: Xử lý mẫu bệnh phẩm bằng nhiệt độ M (+) T1.1 T1.2 T1.3 T2.1 T2.2 T2.3 T3.1 T3.2 T3.3 (-) M (+) K106 K105 K104 K103 K102 K10 K5 K2 K1 T104 T103 T102 T10 T1 500 bp
Kết quả hính 3.11 cho thấy ở tất cả các nồng độ vi khuẩn ở phƣơng pháp xử lý bằng kìt và phƣơng pháp xử lý bằng nhiệt đều thấy 3 vạch DNA tƣơng ứng với sản phẩm của 3 cặp mồi CPS 2J, Sly và 16S rDNA. Nhƣ vậy độ nhạy cũng nhƣ hiệu quả của phƣơng pháp xử lý bằng nhiệt hoàn toàn tƣơng đƣơng với phƣơng pháp xử lý bằng kit chuẩn.
Nhƣ vậy, nhiệt độ 800C trong 60 phút là điều kiện đơn giản nhất để xử lý bệnh phẩm dịch não tủy có chứa vi khuẩn S. suis nhằm mục đìch tách chiết đƣợc
DNA sử dụng trong phản ứng PCR.
Hiện nay, trên thị trƣờng bộ kit dùng để tách chiết DNA có giá thành khá cao. Ví vậy, sự thành cơng của nghiên cứu phƣơng pháp xử lý mẫu bệnh phẩm đơn giản bằng nhiệt độ sẽ góp phần đáng kể trong việc làm giảm giá thành của mỗi mẫu xét nghiệm, làm giảm gánh nặng về kinh tế cho ngƣời bệnh đặc biệt trong tính trạng kinh tế khó khăn nhƣ hiện nay.
Hình 3.12. Hiệu quả xử lý dịch não tủy của bệnh nhân ở 800C/60’(đánh giá bởi PCR đơn mồi)
M: thang chuẩn DNA; (+): chứng dƣơng; (-): chứng âm;
Ở cả 5 mẫu bệnh phẩm, vạch DNA ở vị trì kìch thƣớc 498 bp của cặp mồi đặc hiệu cho typ 2 của vi khuẩn S.suis đều xuất hiện rất rõ nét. Nhƣ vậy phƣơng
pháp xử lý mẫu bệnh phẩm 800C trong 60 phút thìch hợp để xử lý mẫu bệnh phẩm dịch não tủy để bộc lộ DNA của vi khuẩn S.suis.
Hình 3.13. Ứng dụng quy trình PCR đa mồi đã đƣợc xây dựng trên mẫu bệnh phẩm
M: thang chuẩn DNA;
1, 2, 3… 35: 35 mẫu bệnh phẩm (+): chứng dƣơng; (-): chứng âm 101: mẫu bệnh phẩm mô phỏng với nồng độ 10 vk/pƣ
Hính 3.13 cho thấy kết quả chạy PCR đa mồi trên 35 mẫu bệnh phẩm, trong đó có các mẫu bệnh phẩm 16, 17, 24, 25, 26, 31,32 không thấy xuất hiện sản phẩm của PCR đa mồi. Trong số các mẫu còn lại chủ yếu hiện 2 hoặc 3 vạch sản phẩm, chỉ có mẫu 8, 23, 27 và 29 là có 1 vạch sản phẩm. Để khẳng định lại kết quả phân tìch, đối với những mẫu này có thể kiểm tra lại bằng phƣơng pháp PCR đơn mồi. 3.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƢƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI KHI ÁP DỤNG VỚI BỆNH PHẨM LÂM SÀNG
3.3.1. Kết quả nuôi cấy phân lập/xác định đƣợc vi khuẩn từ bệnh phẩm:
Số bệnh phẩm của bệnh nhân đƣợc chẩn đoán VMN mủ nghi do S. suis: 53 Số bệnh phẩm nuôi cấy phân lập xác định là S. suis : 44 mẫu (44/53 trƣờng
hợp nhiễm S. suis)
M (+) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Số bệnh phẩm xác định là S. suis bằng PCR đa mồi: 53 mẫu (53/53 trƣờng hợp
nhiễm S. suis )
3.3.2. Các chi số đánh giá độ chính xác và giá trị hữu ích của các phƣơng pháp
Trong trường hợp tiêu chuẩn để xác định viêm màng não do S. suis là phải dương tính ở phương pháp nuôi cấy phân lập (được coi như chuẩn vàng).
Số mẫu được phân tích bao gồm: tổng số mẫu bệnh phẩm được chẩn đoán lâm sàng VMN mủ nghi do vi khuẩn S. suis là 44 mẫu và số mẫu âm tính thực sự (100