Qui trình tách chiết và tinh chế -mangostin

2.3.2 Tối ưu điều kiện tách chiết

2.3.2.1 Tối ưu dung môi

Cân 5 g bột măng cụt xay, chiết với 30 ml dung môi phân cực như: petroleum ether, ethyl acetate, ethanol, methanol, ủ ở 50C, 5 giờ. Dùng bình định mức chuẩn về cùng thể tích 30 ml, ly tâm thu dịch. Dịch chiết (5 ml) được cho bay hơi đến khối lượng không đổi, cân khối lượng cao chiết, hàm lượng -mangostin trong dịch chiết được kiểm tra trên sắc kí bản mỏng, so sánh tìm ra dung mơi chiết thích hợp.

2.3.2.2 Tối ưu tỷ lệ dung môi chiết

Trong quá trình sản xuất -mangostin ở qui mô công nghiệp, tỷ lệ dung

môi : nguyên liệu không chỉ quyết định đến hiệu suất tách chiết mà còn liên quan Bột vỏ quả măng cụt

Chiết trong ethanol (96%) trong 4 giờ ở 60C theo tỉ lệ 1 g nguyên liệu : 3 ml thể tích, rút chân khơng

Cặn chiết ethanol

Hòa trở lại với nước (1g cao : 20 ml H2O)

Bổ sung n-hexane (1:1)

Thu pha trên

Sắc ký cột silica gel

nghiên cứu sản xuất chế phẩm ở qui mơ phịng thí nghiệm, trước khi sản xuất lượng lớn ở qui mô pilot.

Tách chiết -mangostin với các tỷ lệ dung môi : nguyên liệu là 2:1; 3:1;

4:1 (v/w). Kiểm tra hiệu suất chiết để tìm ra tỷ lệ dung mơi thích hợp.

2.3.2.3 Tối ưu thời gian tách chiết

Bột vỏ măng cụt (2 g) được chiết với tỷ lệ dung môi : nguyên liệu là 3:1, thu dịch chiết theo thời gian khác nhau. Dịch chiết được thu theo giờ, xác định lượng cao chiết, kiểm tra hàm lượng -mangostin bằng phương pháp sắc kí bản mỏng. Từ đó, xác định thời gian chiết tối ưu.

2.3.2.4 Tối ưu nhiệt độ tách chiết

Bột vỏ măng cụt (2 g) được chiết với tỷ lệ dung môi : nguyên liệu là 3:1, ủ ở các nhiệt độ 30C, 40C, 50C, 60C. Dịch chiết sau 4 giờ chiết được chuẩn về cùng thể tích 10 ml. Dịch chiết (5 ml) được cho bay hơi đến khối lượng không đổi, xác định khối lượng cao chiết, hàm lượng -mangostin trong dịch chiết được kiểm tra trên

sắc kí bản mỏng. Xác định nhiệt độ chiết thích hợp. 2.3.3 Các phương pháp tinh sạch

2.3.3.1 Tinh sạch bằng tách phân đoạn

Phương pháp này hiệu quả tinh sạch khơng cao, nhưng tốn ít nguyên liệu, đơn giản. Đây có thể được sử dụng làm bước tinh sạch sơ bộ trước khi tinh sạch bằng sắc kí cột silica gel.

Để loại bỏ các hợp chất tan trong nước, cao chiết được hòa trở lại với nước theo tỷ lệ 1 g cao chiết : 20 ml nước. Hỗn hợp được bổ sung n-hexane, lắc 24 giờ, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút, thu pha trên. Pha trên được sử dụng để tinh sạch bằng cột sắc kí silica gel.

2.3.3.2 Tinh sạch bằng sắc kí cột

Cột thủy tinh được nạp chất hấp phụ đến 2/3 thể tích. Cột được rửa với dung môi nền là n-hexane trong 1 giờ nhằm ổn định cấu trúc. Mẫu được nạp lên cột, thôi

mẫu bằng hỗn hợp dung dịch chloroform : acetone với tỷ lệ 10:1, 5:1, 0:1. Các phân đoạn thu được với tỷ lệ dung môi 5:1 được tinh sạch lần 2 bằng cột silica gel với hệ dung môi n-hexane : ethyl acetate với tỷ lệ 6:1 [19, 22]. Các phân đoạn được kiểm tra độ sạch bằng sắc kí bản mỏng.

2.3.4 Sắc kí bản mỏng

Q trình phân tách hỗn hợp các chất bằng sắc kí bản mỏng xảy ra khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh. Các chất hấp phụ (pha tĩnh) được trải thành lớp mỏng trên tấm kính hoặc lớp kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo một tỷ lệ nhất định. Trong quá trình di chuyển pha di động kéo theo các cấu tử trong hỗn hợp mẫu di chuyển với tốc độ khác nhau tùy theo kích thước và độ phân cực của chúng, do đó tạo nên các băng vạch có giá trị Rf (Rf = khoảng dịch chuyển của cấu tử/khoảng dịch chuyển của dung môi) khác nhau trên sắc kí đồ.

Trong nghiên cứu này, bản sắc kí silica gel 60 F254 được dùng làm pha tĩnh. Pha động là hỗn hợp dung mơi dichlomethane : methanol có tỷ lệ 96:4. Sắc kí đồ được hiện màu bằng phương pháp nhuộm iot.

2.3.5 Xác định làm lượng malondialdehyde

Nguyên lý: Hàm lượng MDA được định lượng theo Ohkawa và cộng sự (1979)

[31]. MDA là một trong những sản phẩm thứ cấp trong q trình peroxy hóa lipid được gây ra bởi các gốc tự do. Trong mơi trường đệm phản ứng thích hợp, chất này sẽ phản ứng với TBA (thiobarbituric acid) tạo ra hợp chất trimethine có màu hồng hấp phụ cực đại ở bước sóng 532-535 nm. Đo độ hấp thụ của phức, suy ra hàm lượng MDA có trong mẫu. Nếu lượng MDA giảm so với mẫu đối chứng, mẫu được xác định là có hoạt độ chống oxy hóa.

Thành phần phản ứng xác định hàm lượng MDA: 300 l dung dịch 8,1% SDS; 300 µl đệm 20% sodium acetate pH 3,5; 300 µl dung dịch 0,8% TBA; 80 µl dung dịch enzyme. Hỗn hợp phản ứng được đun nóng 1 giờ ở 95C, sau đó làm lạnh. Dùng hỗn hợp dung môi n-butanol : pyridine tỷ lệ 15:1 để chiết, lấy dịch trong màu

hồng đo ở bước sóng 532 nm. Hàm lượng MDA được biểu thị bằng đơn vị đo g/g tổ chức với hệ số tắt là  = 1,56 x 105 mol-1 x cm-1.

2.3.6 Xác định hoạt độ peroxidase