Đường chuẩn Bradford với BSA làm chuẩn

2.3.8 Xác định khả năng ức chế vi sinh vật

Một khuẩn lạc được ni lắc 200 vịng/phút ở 37C trong 2 ml môi trường lỏng qua đêm OD600 đạt 1-1,5. Dịch nuôi cấy (10 l) được bổ sung vào 3 ml mơi trường lỏng có chứa hoạt chất -mangostin với các nồng độ khác nhau (mẫu thí nghiệm),

hoặc có chứa dung dịch dùng để hòa tan -mangostin (mẫu đối chứng), ni lắc

200 vịng/phút ở 37C trong 24 giờ. Dịch thử hoạt tính được pha lỗng ở nồng độ 10-6, cấy trải trên môi trường đặc. Sau khi ủ ở 37C qua đêm, đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch. Phần trăm ức chế của hoạt chất so với đối chứng được tính theo cơng thức:

% Ức chế =

Số khuẩn lạc ở mẫu đối chứng

X 100% Số khuẩn lạc ở mẫu thí nghiệm

1 - y = 0.0214x + 0.0414 R2 = 0.9914 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 5 10 15 20 25 30

Hàm lượng BSA (microgram)

OD (595

2.3.9 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa của -mangostin

2.3.9.1 Phương pháp thử nghiệm trên chuột

-Mangostin được thử nghiệm trên đối tượng chuột nhắt trắng nhằm thử nghiệm

hoạt tính chống oxi hóa.

Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng, giống đực, thuần chủng, dòng Swiss, trưởng thành, khỏe mạnh, trọng lượng 22  2 g (n = 72) được chia ngẫu nhiên

thành chia thành 6 nhóm (Bảng 2.5).

Bảng 2.5. Các nhóm chuột xử lí hóa chất.

Nhóm n Cách xử lý

ĐC 12 Uống dung dịch 0,9% NaCl

TN1 12 Gây độc bằng cho uống CCl4

TN2 12 Gây độc bằng cho uống CCl4 + α-mangostin liều 0,1 mg/10 g TT

TN3 12 Uống α-mangostin liều 0,1 mg/10 g TT

TN4 12 Gây độc bằng cho uống CCl4 + α-mangostin liều 0,2 mg/10 g TT

TN5 12 Uống α-mangostin liều 0,2 mg/10 g TT

n: Số cá thể thí nghiệm

Nhóm ĐC: Nhóm chuột đối chứng uống 0,9% NaCl trong 14 ngày với liều lượng 0,1 ml/10 g thể trọng/ngày.

Nhóm TN1: Nhóm gây độc được uống CCl4 trong 14 ngày [17]: hai ngày đầu uống hỗn hợp CCl4 : dầu ăn với tỷ lệ 1:7; mười ba ngày sau với tỷ lệ 1:5. Liều lượng 0,1 ml hỗn hợp/10 g thể trọng/ngày.

Nhóm TN2: Nhóm chuột gây độc bằng cho uống CCl4 có bổ sung uống thêm với α-mangostin liều lượng 0,1 mg/10 g thể trọng/ngày trong 14 ngày.

Nhóm TN3: Nhóm chuột chỉ uống α-mangostin liều lượng 0,1 mg/10 g thể trọng/ngày trong 14 ngày.

Nhóm TN4: Nhóm chuột gây độc bằng cho uống CCl4 có bổ sung uống thêm với α-mangostin liều lượng α-mangostin liều lượng 0,2 mg/10 g thể trọng/ngày trong 14 ngày.

Nhóm TN5: Nhóm chuột chỉ uống α-mangostin liều lượng 0,2 mg/10 g thể trọng/ngày trong 14 ngày.

Trong q trình thí nghiệm nhóm đối chứng và nhóm nghiên cứu đều được ni dưỡng cùng một điều kiện như nhau, hàng ngày được theo dõi, ghi chép diễn biến, cân trọng lượng. Động vật thí nghiệm được uống hoạt chất vào một thời gian nhất định buổi sáng.

2.3.9.2 Phương pháp lấy mẫu gan

Cho chuột nhịn ăn 24 giờ trước khi lấy mẫu thử. Giết chuột bằng cách cắt đầu nhanh. Mổ nhanh lấy gan và cân trọng lượng. Cân 0,3 g gan rửa trong đệm lạnh (100 mM Tris-HCl; 250 mM sucrose, pH 7,4) để loại bỏ máu và catalase. Sau đó được nghiền đồng thể trong cối chày sứ có cát thủy tinh và 300 l đệm lạnh. Dịch nghiền được ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút ở 4C. Bỏ tủa, dịch trong được dùng làm các thí nghiệm xác định hoạt độ và định lượng.

2.3.10 Xử lý số liệu

Phẩn mềm Microsoft excel được sử dụng để xử lý số lượng thu được trong quá trình thực nghiệm và tính các giá trị của các tham số thống kê, biệu thị bằng các biểu đồ thích hợp.

3 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tách chiết và tinh sạch -mangostin từ vỏ quả măng cụt

3.1.1 Tối ưu điều kiện tách chiết

3.1.1.1 Tối ưu dung môi chiết

Hình 3.1. Tối ưu dung mơi chiết.

(A): Sự phụ thuộc của lượng cao chiết vào loại dung môi chiết.

(B): TLC dịch chiết vỏ quả măng cụt với các loại dung môi khác nhau (1): EP; (2): EtOAC; (3): EtOH; (4): MeOH; (5): -mangostin chuẩn.

Sắc kí đồ dịch chiết vỏ quả măng cụt với các loại dung môi đã sử dụng đều cho một băng đậm có Rf = 0,5 cm, trùng với băng -mangostin chuẩn do hãng

Chromadex cung cấp (Hình 3.1B). Giá trị Rf = 0,5 cm của -mangostin khi TLC

dịch chiết vỏ quả măng cụt bằng hệ dung môi dichlomethane : methanol với tỷ lệ 96:4 cho kết quả tương tự với nghiên cứu của Misra và cộng sự (2009) khi sử dụng hệ dung mơi chloroform : methanol với 9:1 có Rf = 0,46 cm [27]. Sự chênh lệch nhỏ giữa hai giá trị Rf trên có thể là do sự khác nhau của các hệ dung môi được chọn làm pha động khi TLC. Khi tách chiết bằng dung môi methanol (MeOH), lượng cao chiết thu được là cao nhất (Hình 3.1A). Tuy nhiên, hình ảnh sắc kí bản mỏng dịch chiết vỏ quả măng cụt bằng các dung môi trên cho thấy hàm lượng

-mangostin trong dịch chiết bằng dung môi ethanol và methanol tương đương

nhau (Hình 3.1B), điều này có thể do trong dịch chiết methanol cịn có lẫn nhiều tạp

1 2 3 4 5 (A) (B) 0.0 0.4 0.8 1.2

EP EtOAC EtOH MeOH

Dung môi chiết

Khối l ượn g c ao chi ết (g ) α-mangostin

chất hơn dịch chiết ethanol. Ngoài ra, với mục đích kinh tế và tính an tồn, dung mơi ethanol được chọn để tách chiết -mangostin.

3.1.1.2 Tối ưu tỷ lệ dung mơi

Hình 3.2. Tối ưu tỷ lệ dung môi chiết.

(A): Sự phụ thuộc lượng cao chiết vào tỷ lệ dung môi.

(B): TLC dịch chiết vỏ quả măng cụt với tỷ lệ dung môi : nguyên liệu khác nhau (1): -mangostin chuẩn; (2) tỷ lệ 2: 1; (3): tỷ lệ 3:1; (4): tỷ lệ 4:1.

Khi chiết bột vỏ măng cụt ở tỷ lệ dung môi : nguyên liệu 3:1 cho lượng cao chiết lớn nhất gần 0,25 g chiếm 12,5% trọng lượng nguyên liệu, và ở tỷ lệ 4:1 cũng cho lượng cao chiết gần tương đương (Hình 3.2A). Hình ảnh sắc kí bản mỏng dịch chiết vỏ quả măng cụt với tỷ lệ dung môi khác nhau cũng cho kết quả tương tự. Dịch chiết bột vỏ quả măng cụt với tỷ lệ dung môi : nguyên liệu khác nhau đều cho cho băng -mangostin có cùng Rf = 0,5 cm, và giống với băng -mangostin chuẩn.

Băng -mangostin ở tỷ lệ dung môi : nguyên liệu là 3:1 và tỷ lệ 4:1 đậm tương

đương nhau và đậm hơn ở tỷ lệ 2:1 (Hình 3.2B). Do đó, với mục đích tiết kiệm nguyên liệu đầu vào, tỷ lệ dung môi : nguyên liệu 3:1 được lựa chọn để tách chiết

-mangostin từ vỏ quả măng cụt.

3.1.1.3 Tối ưu thời gian chiết

Hình ảnh sắc kí dịch chiết bột vỏ quả măng cụt theo thời gian khác nhau đều cho băng tương tự với băng -mangostin chuẩn, có Rf = 0,5 cm. Ở thời điểm 4 và 6 giờ

1 2 3 4 (A) (B) 0 0.1 0.2 0.3 1.5 2.5 3.5 4.5

Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu

Khối l ượn g c ao chi ết (g ) α-mangostin

khẳng định khi khối lượng cao chiết ở thời điểm 4 giờ là cao nhất (Hình 3.3A). Do đó, để có hiệu suất tách chiết cao nhất và tối ưu quy trình, thời gian chiết là 4 giờ được chọn để tách chiết -mangostin từ vỏ quả măng cụt.

Hình 3.3. Tối ưu thời gian chiết.

(A): Sự phụ thuộc của lượng cao chiết vào thời gian chiết.

(B): TLC dịch chiết vỏ quả măng cụt thu ở thời gian khác nhau (1): thời điểm 1 giờ; (2): 2 giờ; (3): 4 giờ; (4): -mangostin chuẩn; (5): 6 giờ.

3.1.1.4 Tối ưu nhiệt độ tách chiết

Hình 3.4. Tối ưu nhiệt độ tách chiết.

A): Sự phụ thuộc của lượng cao chiết vào nhiệt độ chiết.

(B): TLC dịch chiết vỏ quả măng cụt thu ở các nhiệt độ chiết khác nhau (1): 30C; (2): 40C; (3): 50C; (4): 60C; (5): -mangostin chuẩn. 1 2 3 4 5 (A) (B) 1 2 3 4 5 (A) (B) 0.02 0.06 0.1 0.14 0 2 4 6 8

Thời gian (giờ)

Khối l ượn g c ao chi ết (g ) 0.02 0.04 0.06 0.08 20 30 40 50 60 70 Nhiệt độ chiết (độ C) Hàm lư ợng c ao chi ết (g ) α-mangostin α-mangostin

Nhiệt độ tách chiết cũng là một yếu tố hết sức quan trọng trong qui trình sản xuất -mangostin. Nó khơng chỉ ảnh hưởng đến hàm lượng -mangostin thu được

mà còn quyết định đến nguồn nguyên liệu phục vụ cho quá trình tách chiết. Vì vậy, khi sản xuất -mangostin ở qui mơ cơng nghiệp cần chú trọng đến yếu tố nhiệt độ

tách chiết nhằm hạ giá thành sản phẩm. Ở 50C và 60C lượng cao chiết thu được là cao nhất và tương đương nhau (Hình 3.4A). Tuy nhiên, khi sắc kí bản mỏng dịch chiết bột vỏ quả măng cụt thu được, kết quả cho thấy ở 60C có băng -mangostin đậm hơn ở 50C. Do vậy, 60C được chọn làm nhiệt độ tách chiết -mangostin từ bột vỏ quả măng cụt.

3.1.2 Tinh sạch -mangostin

Hình 3.5. Kiểm tra độ sạch của sản phẩm -mangostin tinh sạch.

(A): TLC sản phẩm tinh sạch -mangostin qua cột silica gel (1): -mangostin tinh sạch; (2): -mangostin chuẩn; (3): dịch chiết trước khi đưa lên cột.

(B): Kết quả kiểm tra độ sạch -mangostin bằng HPLC.

Cao chiết chứa hoạt chất -mangostin được tách chiết từ 100 g bột vỏ quả măng cụt bằng dung môi ethanol với tỷ lệ dung môi : nguyên liệu là 3:1, ở 60C, sau 4 giờ. Dịch chiết ethanol được tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp phân tách phân đoạn. Cao chiết ethanol thu được chiếm đến 12,8% khối lượng nguyên liệu ban đầu (Bảng 3.1). Dịch chiết được sử dụng để tinh sạch bằng cột sắc kí silica gel. Lượng

1 2 3

(A) (B)

-mangostin thu được sau khi tinh sạch chiếm 0,13% khối lượng nguyên liệu ban

đầu. Kết quả này thấp hơn so với nghiên cứu của Pothitirat và cộng sự (2008), công bố tách chiết được lượng mangostin bao gồm -mangostin, -mangostin, -mangostin chiếm 9,94% khối lượng nguyên liệu [35]. Tuy nhiên, lượng -mangostin thu được ở đề tài này cao hơn kết quả nghiên cứu của các tác giả:

Iinuma và cộng sự (1996) tách chiết được lượng -mangostin chiếm 0,0019% khối lượng nguyên liệu thô [19]; Ho và cộng sự (2002) thu được lượng -mangostin

chiếm 0,006% nguyên liệu ban đầu. Nguyên nhân có thể do hiệu suất thu hồi trong quá trình sắc kí cột silica gel khơng ổn định, và nguyên liệu có nguồn gốc khác nhau thì hàm lượng -mangostin cũng khác nhau. Ngoài ra, ở đề tài này chỉ tập

trung tinh chế -mangostin, nên khối lượng thu được sẽ thấp hơn trong nghiên cứu của Pothitirat và cộng sự.

Bảng 3.1. Tỷ lệ sản phẩm tách chiết so với nguyên liệu thô.

Sản phẩm So với nguyên liệu thô (%)

Cao chiết ethanol 12,8

Cao chiết n-hexan 0,168

-Mangostin tinh sạch 0,13

Sản phẩm thu được sau khi tinh sạch bằng cột sắc kí silica gel khá tinh khiết so với -mangostin của hãng chromadex. Hình ảnh sắc kí bản mỏng sản phẩm tinh

sạch cho thấy vẫn cịn lẫn một băng có Rf = 0,92 cm (Hình 3.5A). Tuy nhiên, băng này rất mờ, chứng tỏ hàm lượng của chất này rất thấp. Kết quả kiểm tra bằng HPLC cho thấy đô ̣ sa ̣ch của -mangostin đạt 98,5% (Hình 3.5B). Sản phẩm tinh sạch được nhận dạng bằng phương pháp khối phổ, dựa vào phổ C13 và phổ H cho thấy sản phẩm này chính là -mangostin (Hình phụ lục P3 và P4). Như vậy, sản phẩm thu

được đủ độ sạch và độ tin cậy để có thể sử dụng thử nghiệm các hoạt tính sinh học của -mangostin như: hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa trên đối

3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của -mangostin

Hoạt chất -mangostin tinh sạch được bổ sung vào môi trường nuôi cấy các

chủng vi sinh vật gây bệnh ở người như S. aureus, P. aeruginosa, C. albicans, nhằm nghiên cứu tác dụng ức chế của -mangostin đối với sự phát triển của các chủng

trên, đã thu được một số kết quả về khả năng kháng lại các chủng vi sinh vật đó của

-mangostin như sau:

3.2.1 Hoạt tính kháng S. aureus

Hình 3.6. Hoạt tính kháng S. aureus của -mangostin.

(A): Cấy đếm lượng S. aureus trong dịch thử hoạt tính của -mangostin (1): mẫu đối chứng; (2-6): nồng độ -mangostin tương ứng với 2; 5; 10; 15 và 20 g/ml.

(B): Khả năng ức chế S. aureus của -mangostin ở các nồng độ khác nhau.

Tác dụng ức chế sự phát triển vi khuẩn S. aureus của -mangostin khá nhạy, ở

nồng độ 2 g/ml có thể ức chế được 39% sự phát triển của chủng vi khuẩn này. Khi nồng độ hoạt chất -mangostin càng tăng thì khả năng ức chế phát triển vi khuẩn

S. aureus càng tăng, và có thể ức chế hoàn toàn chủng vi khuẩn này ở nồng độ

15 g/ml (Hình 3.6). Kết quả này tương đối phù hợp với nghiên cứu của Sakagami và cộng sự (2005), khẳng định mangostin có thể chống lại S. aureus kháng

methicillin với nồng độ MIC 6,25-12,5 g/ml [37]. Tương tự, Nguyễn Thị Mai

Phương và cộng sự (2010) bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch đã chứng minh rằng chế phẩm XGC (bao gồm các xanthone có trong vỏ quả măng cụt) có hoạt tính

(A) (B) 1 2 3 5 4 6 0 40 80 120 0 5 10 15 20 25 Nồng độ alpha-mangostin (microgram/ml) Tỷ lệ ứ c c hế (%)

ức chế rõ rệt sự sinh trưởng của vi khuẩn S. aureus và S. mutans ở nồng độ

100 g/ml [7].

3.2.2 Hoạt tính ức chế sự sinh trưởng của P. aeruginosa

Khả năng kháng lại vi khuẩn mủ xanh hay P. aeruginosa của -mangostin

không nhạy bằng đối với chủng S. aureus. Ở nồng độ 1000 g/ml -mangostin chỉ có thể ức chế được 70% sự phát triển của chủng vi sinh vật này (Hình 3.7). Tuy nhiên, đây là hoạt tính sinh học quan trọng của -mangostin, sử dụng thuốc từ hoạt chất -mangostin có thể góp phần ngăn ngừa, hạn chế các bệnh nhiễm trùng do trực khuẩn mủ xanh gây ra, đặc biệt là ngăn ngừa hội chứng nhiễm trùng sau phẫu thuật.

3.2.3 Hoạt tính ức chế Candida albicans

Khả năng ức chế tối đa của -mangostin đối với sự sinh trưởng của nấm

C. albicans chỉ đạt khoảng 50% ở nồng độ 1500 g/ml (Hình 3.8). Kết quả này

tương tự với công bố của Kaomongkolgit và cộng sự (2009), khẳng định rằng

-mangostin có khả năng ức chế sự sinh trưởng của nấm C. albican ở nồng độ tối

thiểu là 1000 g/ml [23]. Ở nồng độ lớn hơn 1500 g/ml khả năng ức chế của -mangostin giảm xuống bằng nồng độ 1000 g/ml, có thể do ở nồng độ cao

Hình 3.7. Hoạt tính ức chế sinh trưởng P. aeruginosa.

(A): Cấy đếm lượng P. aeruginosa trong dịch thử hoạt tính của -mangostin (1): mẫu đối chứng; (2-6): nồng độ -mangostin tương ứng với 600; 700; 800; 900 và 1000 g/ml. (B): Khả năng ức chế P. aeruginosa của -mangostin ở các nồng độ khác nhau.

(A) (B) 6 1 2 5 4 3 0 20 40 60 80 0 200 400 600 800 1000 1200 Nồng độ alpha-mangostin (microgram/ml) Tỷ lệ ứ c c hế (%)

-mangotin bị vón kết trong môi trường nuôi cấy, nên khả năng ảnh hưởng của hoạt

chất lên sự sinh trưởng và phát triển của nấm C. albicans bị giảm xuống. Như vậy,

-mangostin có thể được sử dụng làm thuốc hỗ trợ điều trị sau phẫu thuật nhằm

ngăn chặn nguy cơ nhiễm trùng bội nhiễm do nấm Candida gây ra.

Không chỉ dừng ở mục đích sử dụng -mangostin làm thuốc phịng chống một số chứng nhiễm trùng do các loài vi sinh vật gây ra, hoạt chất này còn được sử dụng làm thuốc với mục đích hỗ trợ điều trị và phịng chống oxi hóa, chống ung thư. Vì vậy, giống chuột nhắt trắng dòng Swiss trưởng thành được sử dụng để nghiên cứu khả năng bảo vệ cơ thể động vật thí nghiệm khỏi các tác nhân oxi hóa của hoạt chất

-mangostin.

Hình 3.8. Hoạt tính ức chế nấm C. albicans của -mangostin.

(A): Cấy đếm lượng C. albicans trong dịch thử hoạt tính của -mangostin (1): mẫu đối chứng; (2-6): Nồng độ -mangostin tương ứng với 1000; 1500; 2000; 2500 và 3000 g/ml. (B): Khả năng ức chế C. albicans của -mangostin ở các nồng độ khác nhau.

3.3 Hoạt tính chống oxi hóa của -mangostin

3.3.1 Trọng lượng cơ thể chuột ở các nhóm nghiên cứu

Sau thời gian thử nghiệm uống hoạt chất -mangostin, trọng lượng cơ thể chuột nhắt trắng ở nhóm đối chứng tăng 12% so với trước khi nghiên cứu, trong khi đó nhóm chuột nhiễm độc CCl4 giảm 2,9%. Nguyên nhân do chất độc CCl4 khi vào cơ thể phá hủy màng tế bào, các liên kết protein, peptid, làm cản trở các quá trình sinh

(A) (B) 0 20 40 60 0 1000 2000 3000 4000 Nồng độ mangostin (microgram/ml) Tỷ lệ ứ c c hế (%)