Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU METHYL HÓA
1.5.1. MSP (Methyl Specific PCR)
Kỹ thuật MSP (Methyl Specific PCR) được phát triển bởi Stephen Baylin và Jim Herman tại trường Y Johns Hopkins và được sử dụng để phát hiện methyl hóa các đảo CpG trong ADN của bộ gen [23]
Nguyên lý: Đầu tiên, ADN được biến đổi với sodium bisulfite để chuyển hóa tất
cả các cytosine khơng bị methyl hóa thành uracil, sau đó, ADN này được khuếch đại lên qua phản ứng PCR bằng cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho đoạn trình tự bị methyl hóa và khơng bị methyl hóa. Kỹ thuật MSP địi hỏi lượng ADN rất ít, phát hiện nhạy tới 0,1% các alen bị methyl hóa trên locus đảo CpG quan tâm và cũng có thể thực hiện được với ADN tách chiết từ các mẫu đúc paraffin.
Hình 1.7. Methylate-specific PCR [23]
Chú thích: Methylate-specific PCR bao gồm việc sử dụng hai cặp mồi: cặp 1
được thiết kế để khuếch đại trình tự gen đã xử lý bisulfite (các chấm đen) và cặp 2 là cặp mồi khuếch đại trình tự gen chưa xử lý bisulfite (các chấm trắng). Các cặp mồi được thiết kế sao cho có sự khác biệt về kích thước. Sau khi nhân bản ADN bằng phản ứng PCR sử dụng hai cặp mồi trên, sản phẩm được đem đi điện di trên gel agarose. Kết quả giả thuyết được trình bày như sau: Mẫu 1 cho thấy sản phẩm của cả mồi methyl hố (M) và khơng methyl hóa (U) đều hiển thị; mẫu 2 chỉ chứa ADN không methyl; mẫu 3 chỉ chứa ADN đã bị methyl hóa; và mẫu 4 khơng cho sản phẩm nào. Điện di sử dụng marker L.DNA ladder.
Ưu điểm: Kỹ thuật MSP hạn chế được các kết quả dương tính giả từ các nghiên
cứu trước đó dựa trên PCR và sự phân cắt của enzyme giới hạn để phân biệt giữa ADN bị methyl hóa và khơng bị methyl hóa.
Hiện nay, kỹ thuật MSP được sử dụng phổ biến nhất do tính đơn giản, nhạy và chi phí hợp lý của nó, chủ yếu để phát hiện sự tăng cường methyl hóa tại một vùng promoter quan tâm của một số gen có chức năng quan trọng, liên quan tới sự bất hoạt gen đó trong các bệnh ung thư ở. Đây là kỹ thuật nhanh chóng phát hiện được sự methyl hóa của bất kỳ vị trí CpG nào trong một đảo CpG [23].
1.5.2. Giải trình tự bisulfite
Giải trình tự tồn bộ hệ gen bisulfite (Whole genome bisulfite sequencing), còn được gọi là BS-Seq, là kỹ thuật phân tích hệ gen đầu vào cao cho sự methyl hóa ADN. Nó dựa trên sự chuyển đổi sodium bisulfite ADN hệ gen, sau đó được giải trình tự bằng Next-generation sequencing platform. Các trình tự thu được sau đó được sắp xếp lại với hệ gen tham chiếu để xác định trạng thái methyl hóa của dinucleotide CpG dựa trên sự bắt cặp sai là do việc chuyển các Cytosine khơng bị methyl hóa thành Uracil.
Hình 1.8. Xác định methyl hóa bằng cách sử dụng methylSEQr™ của AB Bisulfite Conversion Kit và thiết bị CE để phân tích DNA [10].
1.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN Ở MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ 1.6.1. Real Time RT-PCR (reverse transcription PCR)