Sử dụng phần mềm MethPrimer để thiết kế mồi, sau đó lựa chọn mồi đáp ứng với các tiêu chí mồi methyl và unmethyl có nhiệt độ Tm tương đối giống nhau và nhân được đoạn gen có cùng kích thước mong muốn. Với tiêu chí trên chúng tơi đã chọn được cặp mồi như sau:
Methyl primer: 5’-TTTTTAAATGAGTAGGTTGTTACGA-3’(Metc-F), 5’-TTTTTAAATGAGTAGGTTGTTACG-3’(Metc-R); Unmethyl primer: 5’-TTTTTTAAATGAGTAGGTTGTTATGA-3’ (UnMetc-F) , 5’-TACCATCTTACAATTCTATAAACACAA-3’(UnMetc-R). Để xác định tính đặc hiệu của mồi MSP, chúng tơi tiến hành blast trên trang dữ liệu Alignment, kết quả thu được cho thấy các vị trí bắt cặp mồi là đặc hiệu, nhân được đoạn trình tự có kích thước mong muốn.
3.2.2. Đánh giá sự methyl hóa của gen SOS1
Các giống lúa 2 tuần tuổi được xử lý mặn ở nồng độ 100mM NaCl và tiến hành thu mẫu sau khi xử lý mặn ở các thời điểm 1 giờ, 3 giờ và 24 giờ sau xử lý mặn. Đồng thời các giống lúa không xử lý mặn cũng được tiến hành thu mẫu song song để làm giống đối chứng. ADN tổng số sau khi được tách chiết đã được xử lý với Sodium Bisulfit và được tinh sạch, sau đó khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi methyl và unmethyl đặc hiệu. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 2%, kết quả điện di thu được ở hình 3.6:
Hình 3.6. Đánh giá sự methyl hóa gen SOS1 bằng PCR (MSP) đối với 4 giống lúa tương ứng được xử lý mặn (100 mM NaCl) và giống đối chứng tại các thời điểm 1,
3, 24 giờ sau xử lý mặn.
Chú thích: Giếng M: Sản phẩm của phản ứng MSP sử dụng cặp mồi methyl hóa
cytosine; Giếng U: Sản phẩm của phản ứng MSP sử dụng cặp mồi khơng methyl hóa cytosine.
Kết quả điện di cho thấy khơng có sự khác biệt đáng kể về tình trạng methyl hóa trong vùng mã của gen SOS1 của tất cả các giống lúa nghiên cứu. Dưới điều kiện thường và điều kiện mặn ở các thời điểm khác nhau, sự khuếch đại chỉ được quan sát bằng cặp mồi được thiết kế cho methyl cytosine trong vùng mã hóa, cho thấy gen SOS1 bị methyl hóa cao trong đảo CpG.
3.2.3. Phân tích vị trí cytosine bị methyl hóa gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn
Để kiểm tra vị trí chính xác của Cytosine bị methyl hóa (đảo CpG, CHG hay CHH) chúng tơi tiến hành giải trình tự bisulfite (sử dụng sản phẩm MSP được khuếch đại từ lá của Nipponbare thu được sau 3 giờ xử lý mặn). Sản phẩm MSP (25μl) đã được tinh sạch bằng cách sử dụng Gel Purification Kit (ThermoScientific) và được gửi đi giải trình tự tại 1st Base Company (Singapore). Trạng thái methyl hóa của ADN thu được bằng cách so sánh trình tự của ADN được xử lý với bisulfit với ADN chưa được xử lý, trong đó chuyển đổi từ C sang T cho thấy C khơng bị methyl hóa, trong khi khơng chuyển đổi từ C sang T cho thấy C đã bị methyl hóa. Kết quả giải trình tự bisulfite tồn bộ đoạn trình tự methyl hóa cao (đoạn b) đối với giống Nipponbare và đoạn trình tự tương ứng trong mẫu đối chứng được trình bày ở hình 3.7:
A. f B. A. B. A. B.
A.
B.