2.2.3.4. Điện di trên gel agarose
Sản phẩm thu được của phản ứng PCR được đem đi điện di trên gel agarose 2% và so sánh với Maker 1kb
2.2.3.5. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm của phản ứng PCR sau đó được tinh sạch sử dụng Kit thôi gel Gene JET PCR Purification Kit của hãng Thermo scientific và được gửi đi giải trình tự. Quy trình được thực hiện như sau: Bước 1 là cắt phần gel chứa ADN vào ống efpendoff 1.5ml sau đó bổ sung thêm 200µl buffer 1 (Binding bufer) gấp 3 lần lượng gel. Ủ ở 60oC trong 10’, 2-3’ vortex 1 lần. Nếu gel chưa tan thì tăng thời gian ủ. Sau khi gel tan hết kiểm tra màu dung dich, màu vàng là đạt. Tiếp đó, đổ dung dịch sang ống “DNA binding colum” ly tâm 13000rpm/1min và đổ dung dịch phía dưới. Tiếp tục bổ sung 100µl buffer 1, ly tâm 13000rpm/1min và cũng đổ dung dich phía dưới. Sau đó, Bổ sung 700µl buffer 2 (wash buffer) vào ống “DNA binding colum”, ly tâm 13000rpm/1min và đổ dung dich phía dưới. Tiếp đến, ly tâm 13000rpm/1min với ống DNA binding colum để loại bỏ wash buffer thừa. Đổ bỏ dung dịch phía dưới, chuyển
sang ống 1.5ml. Sau đó bổ sung thêm 20µl buffer 3 (Elution buffer) vào giữa màng ống. Chờ khoảng 5’ cho dung dich thấm màng. Ly tâm 13000rpm/1min. Thu dung dịch phía dưới có chứa ADN. Tiếp tục lặp lại bước 9 để thu được ADN với nồng độ thấp hơn.
Cuối cùng sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được bảo quản ở -200C trước khi gửi đi giải trình tự .
2.2.4. Nhóm phương pháp sử dụng trong nghiên cứu mức độ biểu hiện gen SOS1 2.2.4.1. Tách chiết ARN tổng số 2.2.4.1. Tách chiết ARN tổng số
Các mẫu được nghiền trong nitơ lỏng, ARN tổng số được tách chiết bằng kit GeneJET Plant RNA purification Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) theo quy trình của nhà sản xuất.
2.2.4.2. Xử lý DNase I, kiểm tra chất lượng ARN
Lá của cả cây đối chứng và cây xử lý mặn đã được thu hoạch sau 1, 3 và 24 giờ sau khi xử lý mặn và ngay lập tức làm lạnh bằng Ni tơ lỏng để phân tích mức độ biểu hiện và phân tích sự methyl hóa. ARN tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra nồng độ ARN bằng đo quang phổ (NanoDrop ND-1000 UV-Vis quang phổ, Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) sau đó được loại bỏ ADN bằng xử lý với DNase I (Thermo Fisher Scientific, USA) và được kiểm tra việc loại bỏ ADN hệ gen bằng qRT- PCR sử dụng mồi khuếch đại trình tự intron của gen OsHKT2; 1 (LOC_Os06g48810). Các mẫu ARN thu được cuối cùng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%.
2.2.4.3. Tổng hợp cDNA
1 μg ARN tổng số được chuyển thành cDNA sử dụng Kit Revert-Aid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Fisher Scientific, USA) với mồi OligodT. Quy trình thao tác được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.4.4. Phản ứng PCR sử dụng mồi đặc hiệu
Tổng thể tích của mỗi phản ứng Real-time PCR định lượng là 20 µl, bao gồm SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Scientific, Hoa Kỳ), khuôn cDNA và một cặp primer thiết kế đặc hiệu cho gen SOS1 hoặc gen Actin 1 với nồng độ sau cùng là 0,4
µM. Các phản ứng được thực hiện trên máy AB ABI Fast 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Chu trình chạy phản ứng bao gồm giai đoạn biến tính ở 95°C trong 10 phút, giai đoạn bắt cặp trong 40 chu kỳ ở 95°C ( trong 15 giây) và giai đoạn kéo dài ở 60°C ( trong 1 phút) sử dụng đĩa 96 giếng. Tính đặc hiệu của phản ứng và kích thước chính xác của ADN khuếch đại được kiểm tra bằng điện di gel agarose và phân tích đường cong nóng chảy. Gen đối chứng Actin1, đã được sử dụng để so sánh sự khác biệt về lượng cDNA đầu vào.
2.2.4.5. Phân tích số liệu
Để kiểm tra độ đặc hiệu hay số sản phẩm được khuếch đại ở mỗi phản ứng, phân tích đường cong nóng chảy DNA (dissociation melting curves) được thực hiện bằng cách giữ ở nhiệt độ 95°C trong 15 giây trước khi gia tăng nhiệt đều từ 60°C lên 95°C. Phương pháp delta Ct được sử dụng để so sánh tương đối mức độ biểu hiện gen ở các giống lúa khác nhau [35].
Phương pháp 2-∆∆Ct của Livak [35]
Đây là phương pháp dùng để nghiên cứu biểu hiện của một gen đột biến so với mẫu tế bào bình thường. Trong phương pháp này, người làm thí nghiệm cần định lượng gen cần nghiên cứu ( Targer = Tg) và một gen tham chiếu hay gen đối chứng ( reference = Ref) tức là gen mà các nghiên cứu trước đó đã xác định là có biểu hiện như nhau giữa hai mẫu tế bào (Mẫu thí nghiệm được gọi là T và mẫu đối chứng được gọi là C). Như vậy ứng với mẫu T và mẫu C sẽ có các kết quả định lượng cho cả gen Tg và gen Ref qua các thơng số:
• Ct (T/Tg): là chu kỳ ngưỡng của gen đích ( Tg) trong mẫu thí nghiệm (T),
• Ct (T/Ref): là chu kỳ ngưỡng của gen tham chiếu (Ref) trong mẫu thí nghiệm (T), • Ct (C/Tg): là chu kỳ ngưỡng của gen đích (Tg) trong mẫu đối chứng (C),
• Ct ( C/Ref): là chu kỳ ngưỡng của gen tham chiếu (Ref) trong mẫu đối chứng (C). Dựa trên các thơng số này, chúng ta sẽ thường hóa ( nomalized) chu kỳ ngưỡng của gen đích trên mẫu thí nghiệm ( T) và mẫu đối chứng (C) bằng cách tính hiệu số chênh lệch Ct của gen đích với gen tham chiếu trên các mẫu:
Mẫu thí nghiệm : ∆Ct(T) = Ct (T/Tg) – Ct( T/Ref) Mẫu đối chứng : ∆Ct (C) = Ct (C/Tg) – Ct ( C/Ref)
Sau đó sẽ thường hóa ∆Ct mẫu thử bằng hiệu số chênh lệch ∆Ct (T) với ∆Ct (C) ∆∆Ct = ∆Ct(T) - ∆Ct (C)
Từ đó tính ra tỷ lệ biểu hiện của gen đích trên mẫu thí nghiệm so với mẫu đối chứng bằng 2-∆∆Ct
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM KIỂU HÌNH
3.1.1. Đánh giá đặc điểm hình thái lá
Bốn giống lúa được trồng thủy canh sử dụng dung dịch dinh dưỡng Yoshida. Sau 14 ngày trồng bình thường, các cây con được xử lý mặn bằng cách bổ sung muối NaCl vào môi trường dinh dưỡng để đạt nồng độ 100mM NaCl. Thí nghiệm xử lý mặn kéo dài hai tuần. Ảnh hưởng của stress mặn lên các cây con được đánh giá thông qua việc đánh giá một số chỉ số hình thái, sinh hóa như : đánh giá đặc điểm lá, chiều cao cây, số nhánh, hàm lượng chlorophyll và diện tích lá.
Chỉ số đặc điểm hình thái lá được sử dụng để phân loại mức độ chịu mặn của lúa [21]. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng chỉ số đặc điểm kiểu hình lá để phân loại mức độ chịu mặn của Dâu Ấn Độ và Nếp Nõn Tre. Kết quả đánh giá đặc điểm lá sau khi tính giá trị xếp hạng trung bình theo Do và cộng sự (2014) [21] cho thấy giá trị xếp hạng của Dâu Ấn Độ, Nipponbare, Nếp Nõn Tre và Pokkali tương ứng là 3,67; 2,33; 1,67 và 1,0 (Hình 3.1).
So sánh giá trị xếp hạng điểm kiểu hình lá thu được với thang đo điểm hình thái kiểu hình lá của Do và cộng sự [21] chúng tôi nhận thấy như sau:
Với quy ước điểm từ 1 đến 9 tương ứng với mức độ chịu mặn cao đến mức độ chịu mặn kém, nghĩa là điểm càng cao, khả năng chịu mặn của cây càng giảm đi. Đối chiếu với kết quả thu được về đặc điểm hình thái lá cho thấy, điểm xếp hạng của giống Dâu Ấn Độ là cao nhất (3,67), sau đó đến giống Nipponbare (2,33), rồi đến giống Nếp Nõn Tre ( 1,67) và cuối cùng là giống Pokkali (1,0). Kết quả cho thấy Dâu Ấn Độ là giống mẫn cảm (giá trị xếp hạng cao hơn Nipponbare), giống này còn mẫn cảm hơn Nipponbare (giống chuẩn mẫn cảm). Nếp Nõn Tre là giống cây chịu mặn trung bình (giá trị xếp hạng trung bình cao hơn Pokkali), giống chịu mặn tốt là Pokkali (giống chuẩn kháng).
3.1.2. Đánh giá đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các giống lúa
Ảnh hưởng của điều kiện mặn đến năng suất lúa là đáng kể sau 14 ngày xử lý NaCl 100 mM và phụ thuộc vào từng giống lúa. Các kết quả thu được cho thấy, hầu hết các giống Nipponbare và Dâu Ấn Độ đã chết trong khi đó giống Nếp Nõn Tre và Pokkali có thể sống sót nhưng cũng bị thiệt hại do chịu tác động của điều kiện mặn.
Để đánh giá được các đặc điểm về chiều cao cây, số nhánh, hàm lượng chlorophyll và diện tích lá, chúng tơi tiến hành loại bỏ những cây bị chết của giống Nipponbare và Dâu Ấn Độ, sau đó chọn 3-5 cây con còn lại của mỗi giống lúa để tiến hành đo, kiểm tra. Tiến hành tương tự với giống Nếp Nõn Tre và Pokkali, kết quả thu được là giá trị trung bình của các thơng số thể hiện trên hình 3.2.
Hình 3.2. Biểu đồ về các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 4 giống lúa trong điều kiện thường và sau 14 ngày xử lý mặn ở 100 mM NaCl.
Quan sát biểu đồ các giá trị thu được ta có thể thấy:
Với giá trị số nhánh cây con trung bình: Ở giống Pokkali, số nhánh cây con tăng lên sau khi xử lý mặn. Trong khi đó, giống Nếp Nõn Tre khơng đổi, cịn hai giống Nipponbare và Dâu Ấn Độ lại giảm đáng kể do ảnh hưởng của mặn với giá trị tương ứng là 2 và 1 (Hình 3.2A).
Với giá trị chiều cao cây trung bình: Các giống Nếp Nõn Tre, Nipponbare và Dâu Ấn Độ đều có chiều cao giảm đáng kể sau khi xử lý mặn, cịn giống Pokkali thì đặc biệt tăng chiều cao sau khi xử lý mặn ( Hình 3.2 B).
Với giá trị hàm lượng Chlorophyll trung bình: Cả 3 giống Pokkali, Nipponbare và Dâu Ấn Độ đều cho giá trị hàm lượng Chlorophyll giảm sau khi xử lý mặn. Trong khi
đó, giống Nếp Nõn Tre lại thể hiện giá trị hàm lượng Chlorophyll tăng sau khi xử lý mặn ( Hình 3.2C).
Với giá trị diện tích lá trung bình: Tất cả 4 giống Pokkali, Nếp Nõn Tre, Nipponbare và Dâu Ấn Độ đều đồng loạt giảm đáng kể diện tích lá ( Hình 3.2.D).
Quan sát tổng thể các giá trị thu được, có thể thấy sau khi xử lý mặn, số nhánh và chiều cao cây của giống Pokkali tăng lên đáng kế, còn hàm lượng chlorophyll và diện tích lá lại giảm đi. Đối với giống Nếp Nõn Tre, số nhánh và hàm lượng Chlorophyll không đổi sau xử lý mặn, còn giảm ở giá trị chiều cao cây và diện tích lá. Khác với giống Pokkali và Nếp Nõn Tre, hai giống Nipponbare, Dâu Ấn Độ giảm đáng kể cả về số lượng nhánh, chiều cao, hàm lượng Chlorophyll và diện tích lá.
Như vậy, chúng tôi đã xác định được 2 giống lúa Nếp Nõn Tre và Dâu Ấn Độ tương ứng thuộc 2 nhóm kháng mặn và giống mẫn cảm mặn. Đối với giống Pokkali và Nếp Nõn Tre, cho thấy khơng có ảnh hưởng đáng kể bởi điều kiện mặn đến chiều cao cây, số nhánh, hàm lượng chlorophyll lá và diện tích lá trong khi những đặc điểm này lại bị giảm đáng kể khi quan sát ở các giống nhạy cảm, Nipponbare và Dâu Ấn Độ.
3.2. ĐÁNH GIÁ SỰ METHYL HÓA CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU
KIỆN MẶN
3.2.1. Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng MSP
3.2.1.1. Xác định vùng methyl của gen
Ở lúa, Gen SOS1 nằm trên nhiễm sắc thể số 12 (LOC_Os12g44360), có độ dài
14451 bp với 1149 axit amin. Theo nghiên cứu của Hoa và cộng sự [40] gen SOS1 có 2 vị trí methyl hóa cao là b, c nằm trên các đảo CpG, CHH và CHG (H = A, C, hoặc T) hình 3.3. Vì vậy trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tơi đánh giá sự methyl hóa của gen ở vùng b.