Chú thích:
Hình 3.7A : Kết quả giải trình tự bisulfite sử dụng cặp mồi Methyl Hình 3.7B: Kết quả giải trình tự mẫu đối xứng khơng xử lý bisulfite
Các vị trí được khoanh vùng trên hình 3.7A thể hiện các vị trí Cytosine bị methyl hóa
khi xử lý bisulfite
Sau khi so sánh các đoạn trình tự nucleotit để tìm ra vị trí Cytosine bị methyl hóa chúng tơi thu được bảng sau:
Bảng 3.1. Các vị trí nucleotit bị methyl hóa
Vị trí nu Vùng trình tự có C bị methyl hóa
59 Đảo CpG
128 Đảo CpG
142 Đảo CpG
149 Đảo CpG
Kết quả cho thấy cả hai cặp mồi MSP đều là methyl cytosines đặc hiệu và chỉ quan sát được ở đảo CpG, không xảy ra ở vùng CHG và CHH.
Như được mơ tả trước đây, mức độ methyl hóa có thể được sử dụng để phân biệt các giống cây chịu mặn. Ví dụ, 10 ngày sau khi xử lý mặn, giống lúa mỳ có khả năng chịu được mặn có mức độ methyl hóa cao hơn giống lúa mỳ nhạy cảm với mặn [56]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 4 giống lúa có mức độ chịu mặn khác nhau,
bao gồm 2 giống chịu mặn (Pokkali, Nếp Nõn Tre) và 2 giống nhạy cảm muối (Nipponbare, Dâu Ấn Độ), nhưng kết quả cho thấy khơng có sự khác biệt về tình trạng methyl hóa giữa các giống lúa chịu mặn và giống mẫn cảm sau khi xử lý mặn (1, 3 và 24 giờ sau khi nhiễm mặn).
3.3. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU
KIỆN MẶN
3.3.1. Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng Real time PCR
Để đánh giá mức độ biểu hiện gen sau khi tách chiết ARN tổng số, tổng hợp cADN và sử dụng phản ứng Real time RT-PCR dùng dye SYBR-Green, trước hết cần phải thiết kế mồi.
3.3.1.1.Thiết kế mồi
Trình tự gen SOS1 (LOC_Os12g44360) và Actin 1 được lấy từ cơ sở dữ liệu ngân hàng gen lúa Rice Genome Annotation project. Sau đó Cặp mồi SOS1-Forward/ SOS1- Reverse được thiết kế bằng phần mềm Primer Blast để sử dụng cho phản ứng PCR nhân đoạn trình tự gen SOS1 từ cDNA của 4 giống lúa Nipponbare, Pokkali, Nếp Nõn Tre và Dâu Ấn Độ đã được xử lý mặn. Trình tự mồi cần đảm bảo khơng chứa cấu trúc bậc hai, các khu vực giàu G/C và A/T được phân bố đồng đều và khơng có các trình tự bổ trợ giữa hai đầu 3’ để tránh hiện tượng tự mồi.
Sử dụng phần mềm Primer-Blast chúng tôi thiết kế được mồi như bảng 2.1
3.3.1.2. Đánh giá độ đặc hiệu mồi
Sau khi thiết kế được mồi cho phản ứng RT-qPCR chúng tơi tiến hành blast trình tự mồi gen SOS1 và gen Actin 1 trên cơ sở dữ liệu NCBI để xác định vị trí bắt cặp mồi trên gen. Kết quả cho 1 cặp mồi duy nhất nhân được đoạn trình tự như mong muốn chứng tỏ rằng, mồi thiết kế là mồi đặc hiệu.
Để kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ở mỗi phản ứng, chúng tơi tiến hành phân tích đường cong nóng chảy DNA (dissociation melting curves) được thực hiện bằng cách giữ ở nhiệt độ 95°C trong 15 giây trước khi gia tăng nhiệt đều từ 60°C lên 95°C, kết quả thu được như hình 3.8.