Điểm Đặc điểm Khả năng chịu mặn
1 Tăng trưởng bình thường, khơng có triệu
chứng bất thường của lá Khả năng chịu mặn cao
3 Sự phát triển gần như bình thường, hoặc vài
lá cuộn lại và màu trắng Có khả năng chịu mặn
5 Tăng trưởng chậm; hầu hết lá cuộn; chỉ có
một số ít phát triển Chịu mặn vừa phải
7 Chấm dứt sự tăng trưởng; hầu hết lá khô;
một số cây chết Nhạy cảm
9 Hầu như tất cả các cây chết Nhạy cảm cao
Với quy ước như trên, điểm đánh giá hình thái lá theo IRRI được tính theo thang điểm 1, 3, 5, 7 và 9, trong đó điểm hình thái lá quy ước là 1, 3 và 5 thể hiện là cây có khả năng chịu mặn. Cịn điểm hình thái lá đạt 7, 9 thể hiện cây mẫn cảm với mặn, khi đạt tới điểm 9 hầu như các cây khơng thể sống sót.
Đồng thời 14 ngày sau khi xử lý mặn, số nhánh, chiều cao cây, hàm lượng chlorophyll và diện tích lá được đo cho mỗi cây. Trong đó, hàm lượng chlorophyll lá được đo bằng máy SPAD-502 (Konica-Minolta, Nhật Bản), diện tích lá được đo bằng máy đo diện tích của Licor-3100C (LI-COR Bioscience, USA). Giá trị thu được là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (Số cây được đo là n = 3 trong mỗi điều kiện). Sau đó, tiến hành so sánh và phân tích dữ liệu thu được.
2.2.2. Thiết kế mồi cho nghiên cứu sự methyl hóa và biểu hiện gen SOS1 ở lúa 2.2.2.1. Thiết kế mồi cho phản ứng MSP
*Mục tiêu thiết kế mồi
Theo nghiên cứu của Hoa và cộng sự [40], gen SOS1 có 2 vị trí methyl hóa cao nằm trong vùng mã hóa của gen, do đó chúng tơi tiến hành nghiên cứu sự methyl hóa trên 1 trong hai vùng trình tự đó. Mặt khác, sản phẩm MSP được giải trình tự cho
kết quả tốt nhất là từ 150-300 bp nên cần thiết kế được cặp mồi phù hợp có thể nhân được đoạn trình tự mong muốn. Các bước thiết kế mồi được tiến hành như sau:
Trình tự gen và trình tự CDS của gen SOS1 được lấy từ dữ liệu ngân hàng gen
lúa : http://rice.plantbiology.msu.edu/. Sử dụng phần mềm Methprimer, chúng tơi dự đốn được các vùng methyl trên gen SOS1 và các cặp mồi tương ứng cho phản ứng MSP. Lựa chọn các cặp mồi đảm bảo các tiêu chí nhân được đoạn trình tự methyl hóa cao như mong muốn từ vị trí exon 10 đến exon 14 để kết quả giải trình tự bisulfit không bị gián đoạn.
2.2.2.1. Thiết kế mồi cho phản ứng RT-PCR
* Mục tiêu thiết kế mồi: Để đánh giá mức độ biểu hiện gen SOS1 sử dụng phản ứng Real time RT-PCR dùng dye SYBR-Green, chúng tôi đã tiến hành các bước thiết kế mồi như sau:
Từ cơ sở dữ liệu ngân hàng gen lúa Rice Genome Annotation project chúng tơi có được trình tự gen SOS1 (LOC_Os12g44360) và Actin 1. Sau đó cặp mồi SOS1-
Forward/ SOS1-Reverse dùng để nhân bản trình tự gen SOS1 và cho gen Actin 1 từ cDNA được thiết kế sử dụng phần mềm Primer Blast. Trình tự mồi cần đảm bảo không chứa cấu trúc bậc hai, các khu vực giàu G/C và A/T được phân bố đồng đều và không có các trình tự bổ trợ giữa hai đầu 3’ để tránh hiện tượng tự mồi. Sau đó, trình tự mồi đặc hiệu được lựa chọn khi nhân gen mong muốn.
2.2.3. Nhóm phương pháp sử dụng trong nghiên cứu sự methyl hóa gen SOS1 2.2.3.1. Tách chiết ADN tổng số bằng phương pháp CTAB 2.2.3.1. Tách chiết ADN tổng số bằng phương pháp CTAB
Để thu ADN tổng số phục vụ cho nhân bản và giải trình tự gen, chúng tơi tiến hành tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB: là phương pháp sử dụng chất có hoạt tính bề mặt là cation. Đây là phương pháp đơn giản nhất thường được sử dụng để tách chiết ADN từ thực vật.
Các bước tiến hành cụ thể: Đầu tiên, cho 50mg mẫu lá lúa đã nghiền vào ống efpendoff 2ml có chứa 500µl dung dịch đệm CTAB buffer 2X, vortex, sau đó ủ ở 650C khoảng 15 phút rồi lấy ra để hạ nhiệt độ. Tiếp tục bổ sung 500µl chloroform/ isoamylalcohol (24:1), vortex trong 15 giây rồi tiến hành ly tâm mẫu ở 10000rpm/10
min, 40C, sau đó thu dịch pha trên (300µl) và chuyển sang ống efpendoff 1,5ml mới có chứa 300µl isopropanol để tủa ADN. Để mẫu trong đá lạnh 10 phút, sau đó lấy ra và ly tâm lần 2 ở điều kiện 14000rpm/5min, 40C rồi rửa tủa bằng 500µl EtOH 700. Tiếp tục ly tâm ở 14000rpm/5min sau đó để khơ. Bước cuối cùng là bổ sung 50µl TE buffer và bảo quản ở -200C.
Sau khi tách chiết ADN tổng số, ADN tổng số được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE (Tris base, acid acetic, EDTA) ở 90V trong 30 phút và được so sánh với maker 1kb và có thể quan sát được dưới tia UV khi nhuộm Ethidium Bromide
2.2.3.2. Xử lý bisulfite
Mẫu ADN tổng số thu được từ phương pháp CTAB sau đó đem xử lý bisulfit sử dụng EpiJET Bisulfite Conversion Kit (Thermo Fisher Scientific, UAS). 500ng AND được xử lý bisulfit để chuyển tất cả các Cytosine không bị methyl hóa thành Uracil sau đó được khuếch đại bằng phản ứng PCR.
2.2.3.3. Phản ứng PCR
Phản ứng PCR với tổng thể tích 50 µl bao gồm các thành phần được trộn theo thứ tự trong bảng 2.3 và chạy PCR với chu trình nhiệt của phản ứng như hình 2.1