Biểu hiện lâm sàng Tần số xuất hiện Tỷ lệ %
Giật cơ 62/62 100%
Động kinh 62/62 100% Phát triển ban đầu bình thƣờng 17/17 100% Sợi cơ đỏ rách nham nhở 47/51 92% Giảm thính lực 41/45 91% Tăng acid lactic máu 24/29 83% Tính kế thừa theo dịng mẹ 34/42 81% Không dung nạp tập thể dục 8/10 80% Mất trí 39/52 75% Bệnh thần kinh 17/27 63% Ngƣời thấp bé 4/7 57% Giảm cảm giác 9/18 50% Liệt dây thần kinh thị giác 14/36 39% Bệnh cơ tim 2/6 33% Hội chứng Wolff-Parkinson-White 2/9 22% Bệnh võng mạc sắc tố 4/26 15%
U mỡ 2/60 3%
Những tác động của hội chứng MERRF lên bệnh nhân là khá đa dạng, phức tạp và không đồng nhất. Các rối loạn của hội chứng MERRF ảnh hƣởng đến nhiều bộ phận của cơ thể, đặc biệt cơ bắp và hệ thần kinh, triệu chứng xuất hiện từ thời thơ ấu hay tuổi vị thành niên. Vì vậy việc phân tích mtDN là quan trọng ở nhiều trƣờng hợp có sự rối loạn hệ thống khơng rõ ràng.
1.3.3. ác phương pháp phát hiện đột biến ERRF
1.3.3.1. Phát hiện đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng PCR kết hợp với RFLP
Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphism) là kỹ thuật phân tích tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DN đƣợc phân cắt giới hạn. Phƣơng pháp này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme giới hạn (restriction enzyme) phân cắt đối với vị trí nhận biết của chúng trên DN . Sự thay đổi về trình tự nucleotide của DN dẫn đến sự thêm hay bớt các điểm phân cắt của enzyme giới hạn, làm cho các đoạn DN bị phân cắt có kích thƣớc khác nhau, có thể nhận biết đƣợc dựa trên phổ băng khi điện di. Theo đó, khi đột biến xuất hiện trong trình tự của DN tại những vị trí giới hạn đặc hiệu sẽ dẫn đến tính đa hình trong chiều dài của các đoạn DN khi đƣợc cắt bởi cùng một loại enzyme giới hạn đặc hiệu. Hiện tƣợng này đ tạo ra sự khác biệt trong chiều dài của các đoạn DN mà khi điện di chúng trên gel thì có thể phát hiện đƣợc các đột biến [25, 30, 45].
Kỹ thuật RFLP đ trở nên đơn giản hơn nhờ có sự phát triển của kỹ thuật PCR (polymerase chain reation). PCR là kỹ thuật phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DN và khả năng kéo dài chuỗi của DN polymerase để nhân bản các đoạn DN khác nhau lên gấp nhiều lần so với ban đầu. DN polymerase hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp khn - mồi, trong mơi trƣờng thích hợp có các dNTP thì sẽ kéo dài mồi thành sợi bổ sung với sợi khn. Vì vậy, để nhân bản đƣợc đoạn DN đích, ngƣời ta cần thiết kế các cặp mồi (primers) đặc hiệu. Đây là một kỹ thuật rất nhạy, chỉ cần một lƣợng nhỏ DN khuôn (ng hoặc thấp hơn) phản ứng cũng có thể diễn ra.
Việc kết hợp PCR-RFLP sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho phát hiện các đột biến di truyền, trong đó có đột biến điểm trên gen ty thể. PCR-RFLP là công cụ chẩn đoán sớm đƣợc s dụng phổ biến nhất để phát hiện các đột biến điểm trong mtDN . Phƣơng pháp này bao gồm các bƣớc chính sau: (1) đoạn mtDN chứa vị trí đột biến đƣợc khuếch đại nhờ các đoạn mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu; (2) sản phẩm PCR đƣợc phân cắt bằng enzyme giới hạn thích hợp; (3) các đoạn DN cắt đƣợc
điện di trên gel agarose hay gel polyacrylamide khơng biến tính, nhuộm ethidium bromide (EtBr) và đƣợc phát hiện dƣới ánh sáng t ngoại. Việc lựa chọn enzyme giới hạn có ý nghĩa quyết định trong việc phát hiện đột biến điểm trong mtDN . Dựa trên trình tự nhận biết của enzyme có sẵn trên đoạn DN chứa đột biến hoặc đƣợc chủ động tạo ra do cách thiết kế mồi trong PCR mà có thể xác định đƣợc đột biến và không đột biến sau phản ứng cắt với enzyme.
Trong hầu hết các phịng thí nghiệm lâm sàng, PCR-RFLP là phƣơng pháp phổ biến nhất đƣợc s dụng để phát hiện nhanh các đột biến điểm gen ty thể. Đây là phƣơng pháp đơn giản và hiệu quả để phát hiện đột biến mtDN khi sàng lọc với số lƣợng mẫu lớn. Tuy nhiên, phƣơng pháp này có độ nhạy tƣơng đối, đơi khi đột biến khó đƣợc phát hiện vì sự có mặt của các băng DN mờ nhạt trên gel nếu tỷ lệ mtDN đột biến trong mẫu thấp [26]. Giới hạn phát hiện của phân tích PCR-RFLP nhuộm ethidium bromide là 5-10% [8].
1.3.3.2. Phân tích đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng xác định trình tự gen
Kỹ thuật giải trình tự đƣợc s dụng để phát hiện, tìm kiếm đột biến trong hệ gen ty thể. Xác định trình tự nucleotide có thể phát hiện và khẳng định chắc chắn loại đột biến trên DN ty thể. Tuy vậy kỹ thuật này tốn nhiều thời gian và chi phí cao, vì vậy nó thƣờng đƣợc s dụng để khẳng định chắc chắn sự có mặt của các đột biến trong đó có đột biến điểm mtDNA [10].
1.3.3.3. Kỹ thuật đa dạng cấu hình sợi đơn SSCP (single-stranded conformational polymorphism) conformational polymorphism)
Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc là trong điều kiện điện di không biến tính, các mạch đơn DN sẽ có cấu trúc nhất định tùy theo trình tự của nó. Các cấu hình khác nhau ngay cả khi chỉ khác biệt một nucleotide. Sự khác biệt này dẫn đến sự khác biệt về khả năng di chuyển trong gel polyacrylamide. Vì vậy, khi xuất hiện đột biến trong phân t mtDN sẽ làm thay đổi cấu trúc bậc hai, cho phép phân tách sợi DN đột biến và khơng đột biến. Phƣơng pháp này có thể áp dụng để sàng lọc đột biến điểm chƣa biết ở bệnh nhân nghi ngờ rối loạn mtDN [12].
1.3.3.4. Định lượng đột biến MERRF bằng phương pháp real-time PCR
Kỹ thuật real-time PCR cho phép phát hiện và định lƣợng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở đo tín hiệu huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lƣợng DN tƣơng ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang đo đƣợc phản ánh số lƣợng sản phẩm đƣợc khuếch đại trong mỗi chu kỳ. Tùy thuộc vào số lƣợng bản DN đích ban đầu có trong ống phản ứng mà giá trị Ct (chu kỳ ngƣỡng) của các mẫu là khác nhau. Dựa vào đặc điểm này có thể xác định số bản sao DN đích có trong mẫu nghiên cứu dựa trên mối quan hệ của mẫu chuẩn đ biết rõ số lƣợng DN đích ban đầu và mẫu nghiên cứu với giá trị chu kỳ ngƣỡng [19, 52].
Ƣu điểm chính của real-time PCR là cho phép xác định số bản sao ban đầu của mẫu DN ở tỷ lệ thấp với độ chính xác và độ nhạy cao. Kết quả real-time PCR có thể tính sự có mặt hay vắng mặt của alen hoặc định lƣợng số bản sao. Ngoài ra, lƣợng sản phẩm DN đích có thể theo dõi đƣợc sau mỗi chu kỳ mà không cần kiểm tra bằng phƣơng pháp điện đi [5, 8].
1.3.3.5. Phát hiện đột biến DNA ty thể bằng hệ thống cảm biến sinh học
Biochip là một kỹ thuật mới, đƣợc s dụng trong sàng lọc phát hiện các đột biến mtDN , với tốc độ rất nhanh, chính xác dựa trên cơ sở phân tích đột biến bằng vi tính.
Để sản xuất các chip DN , các cặp mẫu dò đƣợc thiết kế đặc hiệu cho từng loại đột biến, bao gồm mẫu dị cho trình tự bình thƣờng và mẫu dị cho trình tự đột biến. Mẫu dị đƣợc cài trên phiến kính một cách tự động, mỗi phiến kính với diện tích khoảng 1 cm2 có thể chứa hàng trăm đến hàng ngàn mẫu dị khác nhau. DN khn đƣợc đánh dấu và lai với các mẫu dò. Các phƣơng pháp đánh dấu bao gồm gắn trực tiếp chất đánh dấu vào DN khuôn, PCR với mồi đánh dấu hoặc dùng enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích [71].
Ở Việt Nam, một bệnh nhân MEL S mang đột biến 3243G đ đƣợc phát hiện lần đầu tiên bởi Lê Thị Bích Thảo và tập thể [4] bằng phƣơng pháp PCR-RFLP
và giải trình tự nucleotide. Năm 2014, Trƣơng Thi Huệ và tập thể [55] đ s dụng phƣơng pháp PCR-RFLP sàng lọc 106 bệnh nhân cơ n o tuy nhiên các tác giả không phát hiện đƣợc trƣờng hợp nào mang đột biến thuộc hội chứng MERRF. Nhƣ vậy đột biến MERRF ở bệnh nhân Việt Nam đ đƣợc nghiên cứu tuy nhiên các thơng tin có đƣợc cịn hạn chế. Vì thế, việc mở rộng nghiên cứu phát hiện đột biến này ở ngƣời Việt Nam, đặc biệt là việc định lƣợng mức độ không đồng nhất về kiểu gen đột biến để đƣa ra mối tƣơng quan giữa tỷ lệ đột biến và biểu hiện lâm sàng của bệnh là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao.
HƯ G 2: GUYÊ I U V PHƯ G PH P GHIÊ ỨU 2.1. NGUYÊN LI U
2.1.1. ẫu bệnh phẩm
Mẫu máu ngoại vi của 312 bệnh nhân ngƣời Việt Nam nghi bị bệnh ty thể (Phụ lục 1) đƣợc lấy từ Bệnh viện Nhi Trung ƣơng. Các mẫu máu đƣợc bảo quản ở -80oC. Trong nghiên cứu này, các bệnh nhân đƣợc nghi ngờ mắc hội chứng MERRF dựa trên sự có mặt của ít nhất hai trong ba đặc điểm sau:
- Tác động lâm sàng liên quan đến các cơ quan: hệ thần kinh trung ƣơng, cơ xƣơng và cơ tim, tuyến nội tiết, mắt và hệ tiêu hóa.
- Tăng acid lactic trong máu hoặc dịch n o tủy.
- Hình ảnh chụp cộng hƣởng từ n o khơng bình thƣờng.
2.1.2. ác hóa chất, nguyên liệu khác
Plasmid chèn đoạn gen 8155 - 8366 có và khơng mang đột biến 8344G là sản phẩm của đề tài KC.04.10/11-15
Các kit tách chiết DN tổng số đƣợc mua từ h ng Qiagen; các cặp mồi và mẫu dò đƣợc mua từ h ng Integrated DN Technologies; thang chuẩn DN , hỗn hợp dNTP; (Enzynomics, Hàn Quốc); enzyme giới hạn đƣợc mua từ h ng Thermoscientifics, Kapa probe fast qPCR, Master Mix đƣợc mua của h ng Kapabiosystems.
Các hóa chất cịn lại đều đƣợc mua từ các h ng tin cậy (Sigma, Merk) và đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân t .
2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THI T BỊ
Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao gồm: máy NanoDropTM 8000, máy PCR gradient (Eppendorf), máy real-time PCR iQTM 5 cycler (Biorad), máy ly tâm lạnh 5417 R (Eppendorf), thiết bị điện di ngang, điện di đứng (Biorad) và hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc (Biorad).
2.3. PHƯ G PH P GHIÊ ỨU 2.3.1. Tách chiết tổng số
DN tổng số đƣợc tách và tinh sạch từ máu ngoại vi của các bệnh nhân theo QI amp DN Mini Kit của Qiagen. Quy trình thực hiện nhƣ sau:
Hỗn hợp tách DN chứa 20 µl protease Qiagen, 200 µl mẫu máu, 200 µl đệm L và 4 µl RNase 10 mg/ml. Hỗn hợp đƣợc trộn đều bằng máy vortex trong 15 giây để thu đƣợc một dung dịch đồng nhất và đƣợc ủ ở 56oC trong 10 phút. Sau đó hỗn hợp đƣợc ly tâm nhẹ 3.000 vòng/phút. Tiếp theo, hỗn hợp đƣợc bổ sung 200 µl ethanol 100%, trộn đều và ly tâm nhẹ 3.000 vòng/phút. Dung dịch trong ống đƣợc chuyển vào cột Qiagen, ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút và dịch đi qua cột đƣợc loại bỏ. Cột đƣợc bổ sung 500 µl W1 và ly tâm ở 8.000 vịng/phút trong 1 phút, sau đó dịch đi qua cột đƣợc loại bỏ. Cột tiếp tục đƣợc cho thêm 500 µl W2, ly tâm 14.000 vòng/phút trong 2 phút và dịch đi qua cột đƣợc loại bỏ. Cột đƣợc chuyển sang một ống 1,5 ml sạch khác và đƣợc bổ sung 150 µl nƣớc cất vơ trùng và để yên trong 1 phút, sau đó đƣợc ly tâm ở 8.000 vịng/phút trong 1 phút. Dịch đi qua cột là DN tổng số. Mẫu đƣợc bảo quản ở -20oC cho đến khi s dụng.
2.3.2. iểm tra và định lượng tách chiết
Sự có mặt của DN đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. 5 µl DN đƣợc trộn với 1 µl đệm tra mẫu chứa ethidium bromide (50 µg/ml), tra lên giếng gel agarose 1% trong đệm T E 1X. Điện di đƣợc thực hiện với hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel, các băng DN đƣợc phát hiện dƣới ánh sáng t ngoại.
Nồng độ của DN tách chiết đƣợc định lƣợng bằng cách đo mật độ hấp thụ ánh sáng t ngoại của các acid nucleic ở bƣớc sóng 260 nm ( 260) trên máy Nano- Drop. Nguyên tắc của phƣơng pháp là dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng t ngoại ở bƣớc sóng 260 nm (A260) của các phân t DN . Từ giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 260 nm của các phân t DN , với hệ số 260 = 1 tƣơng đƣơng với hàm lƣợng DN sợi đôi là 50 μg/ml, s dụng công thức C = 260 x 50 x n (trong đó n là số lần pha lo ng) để định lƣợng DN có trong mẫu tách chiết.
Phƣơng pháp này đơn giản, nhanh, nhƣng có hạn chế là giá trị đọc đƣợc về độ hấp thụ có thể bị ảnh hƣởng khi trong mẫu chứa RN và protein. Vì vậy, trong thực tế phƣơng pháp này thƣờng đƣợc dùng để định lƣợng các mẫu DN tinh khiết, tỉ số A260/A280 đƣợc s dụng để đánh giá độ sạch DN của chế phẩm. DN đƣợc cho là sạch khi giá trị 260/A280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0.
2.3.3. hân bản đoạn gen ty thể bằng kỹ thuật P R
Đoạn gen ty thể mang đột biến MERRF đƣợc khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) với các cặp mồi đặc hiệu đ đƣợc thiết kế và chế độ nhiệt thích hợp. Khn cho PCR là DN tổng số đƣợc tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân. Theo tính tốn lý thuyết, các đoạn gen chứa đột biến sẽ đƣợc nhân lên bằng kĩ thuật PCR với kích thƣớc 212 bp (đột biến 8344G), 220 bp (đột biến T8356C), 241 bp (đột biến G8363 ).
Thành phần của phản ứng PCR bao gồm: 2,5 µl đệm Taq DN polymerase 10X; 1 µl Taq DN polymerase (5 đơn vị/ µl); 2,5 µl dNTPs 2 mM; 1 µl mồi xi 10 pmol; 1 µl mồi ngƣợc 10 pmol; 2 µl DN khn (40 - 45 ng/µl) và 15 µl ddH2O cho tổng thể tích 25 µl. Hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn đều, đặt vào máy PCR và tiến hành chạy với 3 bƣớc chính: biến tính DN , gắn mồi và kéo dài chuỗi. Chu trình nhiệt đƣợc thiết lập nhƣ bảng 2.1.
Bảng 2.1: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR các đoạn gen mang đột biến MERRF hu trình nhiệt o C Thời gian Biến tính khởi động 95 4 phút 35 chu kỳ Biến tính 94 30 giây Gắn mồi * 30 giây Kéo dài 72 30 giây Kéo dài hoàn tất 72 5 phút Bảo quản mẫu 4 + ∞ (* là nhiệt độ gắn mồi, MRAG là 58o
Mẫu đối chứng âm tính (khơng chứa DN ) đƣợc đặt cùng thí nghiệm để kiểm tra khả năng nhân bản không đặc hiệu.
Sản phẩm phản ứng sau đó đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%. Sau khi PCR kết thúc, 5 µl sản phẩm đƣợc trộn đều với 1 µl dung dịch đệm tra mẫu có chứa ethidium bromide ở nồng độ 50 µg/ml, tra lên giếng gel đ chuẩn bị trong đệm T E 1X. Thang chuẩn DN 100 bp đƣợc điện di song song cùng với mẫu. Điện di đƣợc thực hiện với hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho đến khi vạch màu cách mép bản gel khoảng 2 cm. Bản gel chứa các băng DN đƣợc quan sát trên máy soi và chụp ảnh bằng hệ thống Geldoc (Biorad).
2.3.4. ỹ thuật P R kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn phân cắt giới hạn (P R-RFLP)
Đoạn gen chứa đột biến đƣợc nhân bản bằng kỹ thuật PCR, sản phẩm PCR sau khi đ kiểm tra trên gel agarose 2% đƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn trong đệm tƣơng ứng (reaction buffer). Phản ứng cắt đƣợc thực hiện với thành phần nhƣ sau: 1 µl đệm enzyme giới hạn 10X; 0,5 µl enzyme giới hạn (50 đơn vị/µl); 7,5 µl sản phẩm PCR và 6,25 µl ddH2O cho tổng thể tích 15 µl, hỗn hợp phản ứng đƣợc giữ ở 37ºC, từ 12-16 giờ. Sau đó, sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 12% và đột biến đƣợc phát hiện dựa vào tính đa hình của các đoạn cắt khi quan sát dƣới ánh sáng t ngoại.
2.3.5. Điện di trên gel agarose
Kỹ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trƣờng tác động vào các phân t tích điện và kích thƣớc lỗ của thể nền (gel). Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao