% đột biến lý thuyết % đột biến thực tế
0,01 0,0 0,1 0,3 1 1,4 10 8,0 30 34,0 50 51,5 70 74,2 100 100,0
Hình 3.10. Sự tương quan giữa tỷ lệ đột biến thực tế và tỷ lệ đột biến lý thuyết
Kết quả thu đƣợc ở hình 3.10 cho thấy giới hạn phát hiện đột biến của phƣơng pháp thiết lập đƣợc là 0,1%, sự tƣơng quan tuyến tính giữa tỷ lệ đột biến thực tế và lý thuyết có độ tin cậy cao (R2 = 0,997). Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần cho kết quả giống nhau. Nhƣ vậy đƣờng chuẩn chúng tơi thiết lập đƣợc có độ tin cậy và độ nhạy tƣơng đƣơng với nghiên cứu của Trƣơng Thị Huệ và tập thể (2012) trong việc xây dựng đƣờng chuẩn định lƣợng đột biến A3243G bằng phƣơng pháp real-time PCR s dụng mẫu dò Taq man LN (độ nhạy đạt 0,1%, R2=0,999) [1].
3.3.3. Thử nghiệm khả năng phát hiện và định lượng đột biến 8344G
Trong 312 mẫu bệnh phẩm đ sàng lọc bằng phƣơng pháp PCR-RFLP, chúng tôi không phát hiện đƣợc trƣờng hợp nào mang đột biến 8344G. Để khẳng định thêm về kết quả này chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 5 mẫu bệnh phẩm (kí hiệu BN1, BN2, BN3, BN4, BN5) và th nghiệm bằng phƣơng pháp real-time PCR đ đƣợc thiết lập ở trên.
Kết quả định lƣợng ở hình 3.11 cho thấy cả 5 mẫu bệnh phẩm đƣợc th nghiệm chỉ thu đƣợc tín hiệu F M, là tín hiệu khơng đột biến trong khi đó tín hiệu HEX là tín hiệu đột biến đều khơng phát hiện đƣợc. Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng có độ tuyến tính cao (R2 > 0,99). Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần cho kết quả giống nhau. Vì vậy chúng tơi một lần nữa khẳng định 5 mẫu bệnh phẩm này đều không mang đột biến 8344G, sự phù hợp về kết quả của hai phƣơng pháp PCR- RFLP và real-time PCR s dụng mẫu dị huỳnh quang LNA.
Hình 3.11. Thử nghiệm định lượng 5 mẫu bệnh phẩm không mang đột biến A8344G bằng real-time PCR
3.4. S G Ọ ĐỘT BI GE THUỘ HỘI HỨ G ERRF BẰ G PHƯ G PH P GI I TRÌ H TỰ TRỰ TI P
Nhƣ đ nêu ở trên, qua sàng lọc bằng PCR-RFLP, chúng tôi đ không phát hiện đƣợc trƣờng hợp nào mang các đột biến A8344G, T8356C và G8363A thuộc hội chứng MERRF. Để một lần nữa khẳng định kết quả nghiên cứu bằng PCR- RFLP là chính xác chúng tơi đ lựa chọn 29 mẫu bệnh nhân nghi ngờ (Phụ lục 1) bị hội chứng MERRF với triệu chứng rõ nhất để giải trình tự đoạn gen 8155 - 9292 thuộc vùng các đột biến này.
Phân tích trình tự vùng gen mang đột biến ERRF 8155 - 9292 trên hệ gen ty thể
Đoạn gen ty thể 8155 - 9292 dài 1137 bp của 29 bệnh nhân nghi bị MERRF đƣợc chúng tôi nhân gen từ phản ứng PCR với khuôn là mẫu DNA bệnh phẩm đƣợc nhân lên bằng PCR và giải trình tự nucleotide s dụng mồi theo cả hai chiều. Kết quả phân tích trình tự thu đƣợc cho thấy khơng có trƣờng hợp nào mang đột biến A8344G, T8356C và G8363A của hội chứng MERRF (Hình 3.12). Nhƣ vậy, kết quả xác định trình tự một lần nữa khẳng định kết quả phân tích bằng PCR-RFLP là chính xác và đáng tin cậy.
Hình 3.12. Kết quả blast của trình tự đoạn gen ty thể 8155 - 9292 của 29 mẫu bệnh với trình tự chuẩn J01415.2
K T LUẬN
1. Đ sàng lọc 3 đột biến thuộc hội chứng MERRF, trên bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể (312 bệnh nhân đối với đột biến 8344G và 182 bệnh nhân đối với đột biến T8356C và G8363 ) bằng phƣơng pháp PCR-RFLP nhƣng không phát hiện đƣợc trƣờng hợp nào mang đột biến.
2. Đ thiết kế thành cơng mẫu dị Taqman mang nucleotide dạng khóa cầu methyl và thiết lập đƣợc điều kiện để phân tích định lƣợng đột biến 8344G của hội chứng MERRF bằng real-time PCR với giới hạn phát hiện đến 0,1% với độ tin cậy cao (hệ số R2 = 0,997)
3. Đ giải trình tự trực tiếp đoạn gen ty thể 8155 - 9292 (1137 bp) của 29 mẫu bệnh nhân trong số các bệnh nhân có biểu hiện bệnh thần kinh cơ và cho kết quả âm tính về đột biến 8344G, T8356C, G8363 bằng PCR-RFLP và tái khẳng định tất cả các bệnh nhân này đều không mang 1 trong 3 các đột biến vừa nêu.
I GHỊ
1. Tiếp tục sàng lọc để phát hiện các đột biến MERRF trên bệnh nhân nghi mắc bệnh thần kinh, cơ n o ở Việt Nam.
2. Xây dựng phƣơng pháp phát hiện, định lƣợng các đột biến gen ty thể khác nhằm hỗ trợ việc chẩn đoán lâm sàng và nghiên cứu mối liên quan giữa mức độ biểu hiện bệnh với tỷ lệ đột biến.
TÀI LI U THAM KH O Tiếng Việt
1. Trƣơng Thị Huệ, Nguyễn Văn Liệu, Phạm Vân nh, Nguyễn Thị Vân nh, Phan Tuấn Nghĩa (2012), “Phát hiện và định lƣợng đột biến 3243G trong hệ gen ty thể ở hội chứng MEL S”, Tạp chí cơng nghệ sinh học,
10(3), tr. 423-429.
2. Phùng Bảo Khánh, Nguyễn Văn Minh, Trần Đức Hiệp, Trần Kiều nh, Trƣơng Thị Huệ, Phạm Vân nh, Lê Ngọc nh, Cao Vũ Hùng, Phan Tuấn Nghĩa (2015), “Phát hiện đột biến gen ty thể 1555G gây bệnh điếc cảm ứng bởi minoglycoside ở một số bệnh nhân ngƣời Việt Nam”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN – Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ , 31(3), tr. 1-7.
3. Nguyễn Văn Minh, Phùng Bảo Khánh, Trƣơng Thị Huệ, Cao Vũ Hùng, Phạm Vân nh, Nguyễn Thị Hồng Loan, Phan Tuấn Nghĩa (2015), “Sàng lọc đột biến G3460 , G11778 và phát hiện đột biến mất đoạn 6 bp mới trên hệ gen ty thể bệnh nhân thần kinh cơ Việt Nam”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 13(2), tr. 1-7.
4. Trịnh Lê Phƣơng, Chu Văn Mẫn, Phan Tuấn Nghĩa (2009), “Phát hiện đột biến gen A3243G của hội chứng MELAS bằng phƣơng pháp PCR-RFLP cải tiến”, Tạp chí Di truyền và ứng dụng, 4, tr. 6-9.
5. Phạm Hùng Vân (2009), PCR và real-time PCR – Các vấn đề cơ bản và các áp
dụng thường gặp, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
Tiếng nh
6. Abbott J. A., Francklyn C. S., Robey-Bond S. M. (2014), “Transfer RN and human disease”, Frontiers in Genetics, 5(158), pp. 1-18.
7. Abreu-Silva R. S., Lezirovitz K., Braga M. C. C., Spinelli M., Pirana S., Della- Rosa V. A., Otto P. A., Mingroni-Netto R. C. (2006), “Prevalence of the A1555G (12S rRNA) and tRNASer (UCN) mitochondrial mutations in hearing-impaired Brazilian patients”, Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 39, pp. 219-226.
8. Bai R. K., Wong L. J. C. (2004), “Detection and quantification of heteroplasmic mutant mitochondrial DNA by real-time amplification refractory mutation system quantitative PCR analysis: A single-step approach”, Clinical Chemistry, 50, pp. 996-1001.
9. Berdanier C. D. (2005), Mitochondria in healthy and disease, CRC Press.
10. Blakely L. E., Alston L. C., Lecky B., Chakrabart B., Falkous G., Turnbull M. D., Taylor W. R., Gorman S. G. (2014), “Distal weakness with respiratory insufficiency caused by the m.8344 > G “MERRF” mutation”, Science Direct, 24, pp. 533–536.
11. Blasiak J., Glowacki S., Kauppinen ., Kaarniranta K. (2013), “Mitochondrial and Nuclear DNA Damage and Repair in Age-Related Macular Degeneration”, International Journal of Molecular Sciences, 14(2), pp.
2996-3010.
12. Bornsttein B., Mas J. A., Patrono. C., Fernández-Moreno M. A., González- Vioque E., Campos. Y., Carrozzo. R., Martín. M. A., Del Hoyo . P., Santorelli. F. M., Arenas J., Garesse R. (2005), “Comparative analysis of the pathogenic mechanisms associated with the G8363A and A8296G mutations in the mitochondrial tRNA Lys gene”, Biochemical Journal, 387, pp. 773–77.
13. Boulet L., Karpati G., Shoubridge E. A. (1992) “Distribution and threshold expression of the tRNA-lys mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF)”, The American Journal of Human Genetics, 51(6), pp. 1187 - 1200.
14. Burgstaller J. P., Johnston I. G., Poulton J. (2015), “Mitochondrial DN disease and developmental implications for reproductive strategies”, Molecular Human Reproduction, 21(1), pp.11-22.
15. Calabresi P. ., Silvestri G., Dimauro S., Grigga R. C. (1994), “Ekbom’s syndrome: Lipomas, ataxia, and neuropathy with MERRF”, Muscle and Nerve, 17, pp. 943-945.
16. Cao Y., Ma Y., Zhang Y., Li Y., Fang F., Wang S., Bu D., Xu Y., Pei P., Li L., Xiao Y., Wua H, Yang Y., Zou L., Qi Y. (2010), “Detection of eight frequently encountered point mutations in mitochondria in Chinese patients suggestive of mitochondrial encephalomyopathies”, Mitochondrion, 10, pp.
330-334.
17. Chong J. W., Annuar A. A, Wong W. T., Thong M. K., Goh K. J. (2014), “Single mitochondrial DN deletions in chronic progressive external ophthalmoplegia (CPEO) and Kearns-Sayre syndrome (KSS) patients from a multiethnic Asian population”, Neurology Asia, 19(1), pp. 27-36.
18. Cohen H. B. (2013), “Neuromuscular and Systemic Presentations in dults: diagnoses beyond MERRF and MEL S”, Neurotherapeutics, 10, pp. 227–
242.
19. Craven L., Tuppen H. A., Greggains G. D., Harbottle S. J., Julie L., Murphy, Cree L. M., Murdoch A. P., Chinnery P. F., Taylor R. W., Lightowlers R. N., Herbert M., Turnbull D. M. (2010), “Pronuclear transfer in human embryos to prevent transmission of mitochondrial DN disease”, Nature,
465(7294), pp. 82-85.
20. De la Mata M., Garrido-Maraver J., Cotán D., Cordero M. D., Oropesa-Ávila M., Izquierdo L. G., De Miguel M., Lorite J. B., Infante E. R., Ybot P., Jackson S., Sánchez-Alcázar J. A. (2012), “Recovery of MERRF Fibroblasts and Cybrids Pathophysiology by Coenzyme Q10”,
Neurotherapeutics, 9, pp. 446-463.
21. Detmer S. ., Chan D. C. (2007), “Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics”, Nature Publishing Group, 8, pp. 870-879.
22. Duchen M. R. (2004), “Roles of Mitochondria in Health and Disease”,
Diabetes, 53, pp. 96-102.
23. Duchen M. R., Szabadkai G. (2010), “Role of mitochondria in human disease”,
24. El-Hattab . W., Scaglia F. (2013), “Mitochondrial DN Depletion Syndromes: Review and Updates of Genetic Basis, Manifestations, and Therapeutic Options”, Neurotherapeutics, 10, pp. 186-198.
25. Emmanuele V., Silvers D. S., Sotiriou E., Tanji K., DiMauro S., Hirano M. (2011), “MERRF and Kearns-Sayre overlap syndrome due to the mtDNA m.3291T>C mutation”, Muscle Nerve., 44(3), pp. 448–451.
26. Fan H., Civalier C., Booker J. K., Gulley M. L., Prior T. W., Farber R. A. (2006), “Detection of common disease-causing mutations in mitochondrial DNA (Mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis with stroke-like episodes MTTL1 A3243G and myoclonic epilepsy associated with ragged- red fibers MTTK A8344G) by real-time polymerase chain reaction”, Journal
of Molecular Diagnostics, 8, pp. 277-281.
27. Fawcett D. W. (1981), The Cell, W. B. Saunders Company, NewYork.
28. Fukuhara N., Tokiguchi S., Shirakawa K., Tsubaki T. (1980), “Myoclonus epilepsy associated with ragged-red fibers (mitochondrial abnormalities) disease entity or a syndrome”, Journal Neurol Science, 4791, pp. 117-133. 29. Giles R. E. (1980), “Maternal inheritance of human mitochondria DN ”,
Genetics, 77, pp. 6715-6719.
30. Graf W.D., Sumi S. M., Copass M. K., Ojemann L. M., Longstreth W. T., Shanske S., Lombes ., DiMauro S. (1993), “Phenotypic Heterogeneity in families with the Myoclonic Epilepsy and Ragged-Red Fiber Disease Point Mutation in Mitochondrial DN ”, American Neurological Association, 33,
pp. 640-645.
31. Greaves L. C., Reeve A. K., Taylor R. W., Turnbull D. M. (2012) “Mitochondrial DNA and disease”, The Journal of Pathology, 226, pp. 274- 286
32. Green R. D., Reed C. J. (1998), “Mitochondria and apoptosis”, Science, 281,
33. Hammans S. R., Sweeney M. G., Brockington M., Lennox G. G., Lawton N. F., Kennedy C. R., Morgan-Hughes J. ., Harding . E. (1993), “The mitochondrial DNA transfer RNALys AG(8344)
mutation and the syndrome of myoclonic epilepsy with ragged red fibres (MERRF): Relationship of clinical phenotype to proportion of mutant mitochondrial DN ”, Brain,116, pp. 617-632.
34. Jeong S. Y., Seol D. W. (2007), “The role of mitochondria in apoptosis”, B. M. B. reports, pp. 11-22.
35. Krauss S. (2001), “Mitochondria: Structure and Role in Respiration”,
Encyclopedia of Life Sciences, pp. 1- 6.
36. Kwon S. J., Park S. S., Kim J. M., Ahn T. B., Kim S. H., Kim J., Lee S. H., Ha C. K., Ahn M. Y., Jeon B. S. (2004), “Investigation of common mitochondrial point mutations in Korea”, Genes and apoptosis to aging and
disease, 1011, pp. 339-344.
37. Lorenzoni P. J., Scola R. H., Kay C. S. K., Silvado C. E. S., Werneck L. C. (2014), “When should MERRF (myoclonus epilepsy associated with ragged-red fibers) be the diagnosis?”, Arquivos Neuro-psiquiatria (tên đầy
đủ), 72(10), pp. 803-881.
38. Masucci J. P., Davidson M., Koga Y., Schon E. ., King . P. (1995), “In Vitro Analysis of Mutations Causing Myoclonus Epilepsy with Ragged-Red Fibers in the Mitochondrial tRNA Lys Gene: Two Genotypes Produce Similar Phenotypes”, Molecular Cellular Biology, 15(5), pp. 2872-2881. 39. Mfinschef C., Rieger T., Miiller-Huckerb J., Kadenbach B. (1993), “The point
mutation of mitochondrial DNA characteristic for MERRF disease is found also in healthy people of different ages”, Federation of European Biochemical Societies letters, 317(1), pp. 27-30.
40. Mimaki M., Hatakeyama H., Ichiyama T., Isumi H., Furukawa S., Akasaka M., Kamei ., Komaki H., Nishino I., Nonaka I., Goto Y. (2009), “Different effects of novel mtDNA G3242A and G3244A base changes adjacent to a common A3243G mutation in patients with mitochondrial disorders”,
41. Musumeci O., Andreu A. L., Shanske S., Bresolin N., Comi G. P., Rothstein R., Schon E. A., DiMauro S. (2000), “Intragenic inversion of mtDN : new type of pathogenic mutation in a patient with mitochondrial myopathy”, The American Journal of Human Genetics, 66, pp. 1900-1904. 42. Noer A. S., Sudoyo H., Lertrit P., Thyagarajan D., Utthanaphol P., Kapsa R.,
Byrnet E., Marzuki S. (1991), “ tRN Lys Mutation in the mtDNA is the Causal Genetic Lesion Underlying Myoclonic Epilepsy and Ragged-Red Fiber (MERRF) Syndrome”, The American Society of Human Genetics, 49,
pp. 715-722.
43. Pulkes T., Hanna M. G. (2001), “Human mitochondrial DN diseases”,
Advanced Drug Delivery Reviews, 49, pp. 27-43.
44. Qi Y., Zhang Y., Wang Z., Yang Y., Yuan Y., Niu S., Pei P., Wang S., Ma Y., Bu D., Zou L., Fang F., Xiao J., Sun F., Zhang Y., Wu Y., Wang S., Xiong H., Wu X. (2006), “Screening of common mitochondrial mutations in Chinese patients with mitochondrial encephalomyopathies”,
Mitochondrion, 7, pp. 147-150.
45. Santorelli F. M., Mak S. C., El-Schahawi M., Casali C., Shanske S., Baram T. Z., Madrid R. E., DiMauro S. (1996), “ Maternally Inherited Cardiomyopathy and Hearing Loss Associated with a Novel Mutation in the Mitochondrial tRN 1LY Gene (G8363 )”, The American Journal of Human Genetics, 58, pp. 933-939.
46. Sato M., Sato K. (2013), “Maternal inheritance of mitochondrial DN by diverse mechanisms to eliminate paternal mitochondrial DN ”, Biochimica et Biophysica Acta, 1833, pp. 1979-1984.
47. Seibel P., Degoul F., Bonne G., Romero N., Frangois D., Paturneau-Jouas M., Ziegler F., Eymard B., Fardeau M., Marsac C., Kadenbach B. (1991), “Genetic biochemical and pathophysiological characterization of a familial mitochondrial encephalomyopathy (MERRF)”, Journal of the Neurological
48. Sena L. ., Chandel N. S. (2012), “Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species”, Molecular Cell, 48(2), pp. 158-167.
49. Shanske S., Goodman S., Sue C. M., Bruno C., Johnson T. L., Lava N. S., Waheed N., DiMauro S. (2000), “G8363A mutation in the mitochondrial DNA transfer ribonucleic acid Lys gene: another cause of Leigh syndrome”,
Journal of Child Neurology, 15(11), pp. 759-761.
50. Shoffner J. M., Wallace D. C. (1992), “Mitochondrial Genetics: Principles and Practice”, The American Journal of Human Genetics, 51, pp. 179-1186. 51. Silvestri G., Moraes C. T. , Shanske S., Oh S. J., DiMauro S. (1992), “ New
mtDNA Mutation in the tRNA Lys Gene Associated with Myoclonic Epilepsy and Ragged-Red Fibers (MERRF)”, The American Journal of Human Genetics, 51, pp. 1213-1217.
52. Szuhai K., Ouweland J. M., Dirks R. W., Lemtre M., Truffert J. C., Janssen J. M., Tanke H. J., Holme E., Maassen J. A., Raap A. K. (2001), “Simultaneous A8344G heteroplasmy and mitochondrial DNA copy number quantification in Myoclonus Epilepsy and Ragged-Red Fibers (MERRF) syndrome by a multiplex Molecular Beacon based real-time fluorescence PCR”, Nucleic Acids Research, 29(3), pp. 1-6.
53. Taylor R. W., Morris A. A. M., Hutchinson M., Turnbull D. M. (2002), “Leigh disease associated with a novel mitochondrial DN ND5 mutation”,
European Journal of Human Genetics, 10, pp. 141-144.
54. Taylor R. W., Turnbull D. M. (2007), “Mitochondrial DN mutations in human disease”, Nature Review Genetics, 6(5), pp. 389-402.
55. Truong T. H., Nguyen T. V. A., Nguyen V. L., Pham V. A., Phan T. N. (2014), “Screening of common point-mutations and discovery of new T14727C change in mitochondrial genome of Vietnamese encephalomyopathy patients”, Mitochondrial DNA, 27, pp. 441-448.
56. Tuppen H. A., Blakely E. L., Turnbull D. M., Taylor R. W. (2010), “Mitochondrial DN mutations and human disease”, Biochimica et Biophysica Acta, 1797, pp. 113–128.
57. Virgilio R., Ronchi D., Bordoni A., Fassone E., Bonato S., Donadoni C., Torgano G., Moggio M., Corti S., Bresolin N., Comi G. P. (2009), “Mitochondrial DNA G8363A mutation in the tRNA Lys gene: clinical, biochemical and pathological study”, Journal Neurol Science, 281(1-2), pp.