Hình 2.1. Cấu trúc của nucleotide cải biến dạng LNA
Nguyên tắc của phƣơng pháp: Mẫu dò huỳnh quang bao gồm một đoạn nucleotide bắt cặp đặc hiệu với trình tự đích. Khi chƣa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DN đích thì mẫu dị Taqman vẫn cịn ngun vẹn, huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ bị quencher hấp phụ do nguyên lý cộng
hƣởng năng lƣợng huỳnh quang (nguyên lý FRET), ống phản ứng sẽ không phát đƣợc huỳnh quang khi nhận đƣợc nguồn sáng kích thích. Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì mẫu dị huỳnh quang sẽ bắt cặp với khn và bị hoạt tính 5’-exonuclease của enzyme Taq DN polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung, do vậy reporter sẽ rời xa quencher và phát huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích (Hình 2.2). Sự phân cắt của mẫu dị trong q trình PCR đ giải phóng reporter làm tăng mật độ huỳnh quang. Sản phẩm khuếch đại càng nhiều thì số lƣợng reporter tự do càng nhiều và cƣờng độ huỳnh quang phát ra càng lớn và máy sẽ ghi nhận đƣợc.
Bảng 2.3: Trình tự của mồi và mẫu dò dùng cho real- time PCR
Mẫu dị/Mồi Trình tự Vị trí trên DNA
ty thể
RT8344-Fw 5’ GC CC CTG T GC T C 3’ 8291 – 8309 RT8344-Rv 5’ GGC TT TC CTG T G GGT 3’ 8370 – 8350 Wt-8344A-
FAM
6FAM-AGA T+TA +A+GA +GA+A +CC-
IBFQ 8332 – 8346
Mt-8344G- HEX
HEX-GAT +TA+A +GAG +A+GC C-
IBFQ 8333 – 8346
Ghi chú: dấu + chỉ nucleotide LNA
Đoạn DN chứa đột biến 8344G dài 80 bp từ vị trí 8291 - 8370 đƣợc nhân bản với cặp mồi RT8344-Fw và RT8344-Rv và nucleotide đột biến đƣợc phát hiện bằng mẫu dò đặc hiệu Wt-8344A-FAM và Mt-8344G-HEX.
Thành phần của phản ứng real-time PCR gồm qPCR master mix (2X), 1 µmol/L mỗi loại mồi, 0,125 µmol/L mỗi loại mẫu dị (Wt-8344A-FAM/Mt-8344G- HEX) và 10 ng DN khn cho tổng thể tích 25 l. Real-time PCR đƣợc thực hiện với chế độ nhiệt 95°C, 10 phút tiếp nối 40 chu kỳ với 95°C, 15 giây để biến tính và 60°C, 60 giây để bắt cặp và kéo dài chuỗi.
Cƣờng độ tín hiệu huỳnh quang đƣợc ghi nhận và phân tích bởi hệ thống iQ5 cycler (Biorad). Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt, các mẫu chuẩn và mẫu phân tích có các đƣờng biểu diễn khuếch đại tƣơng ứng. Từ giá trị chu kỳ ngƣỡng (Ct) của mẫu nghiên cứu, dựa vào đƣờng chuẩn đƣợc thiết lập bằng cách trộn mẫu DN plasmid mang đột biến và không mang đột biến với các tỷ lệ khác nhau từ đó tính ra phần trăm đột biến của mẫu phân tích.
D y DN plasmid từ 5.102
-5.107 bản sao/µl (hệ số pha lo ng 10) chứa trình tự đột biến và khơng đột biến đƣợc trộn theo tỷ lệ 1:1 ở cùng nồng độ chạy cùng với mẫu trong mỗi phản ứng. Lƣợng đột biến trong mỗi mẫu đƣợc đo 3 lần (n = 3) và số liệu đƣợc x lý theo phƣơng pháp thống kê.
2.3.8. Giải trình tự đoạn gen chứa đột biến
Trình tự đoạn gen đƣợc xác định dựa theo phƣơng pháp Sanger (kết thúc bằng đầu tận cùng chứa dideoxynucleotide - ddNTP) thông qua dịch vụ phân tích bởi Cơng ty 1st base (Singapore). Do ddNTP chỉ chứa đầu 3’-H thay cho 3’-OH nên khi các nucleotide này đƣợc gắn vào chuỗi DN đang đƣợc tổng hợp thì chúng sẽ làm cho quá trình kéo dài chuỗi bị ngừng lại. Theo đó, từ một đoạn DN khuôn ban đầu sẽ tổng hợp nên nhiều đoạn sợi đơn mới đƣợc đánh dấu ở một đầu tận cùng là ddNTP và các đoạn này có độ dài hơn kém nhau một nucleotide. Các đoạn sợi đơn đó đƣợc phân tách trên gel acrylamide dạng mao quản và máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích kết quả để đƣa ra trình tự đoạn DN gốc.
HƯ G 3: K T QU VÀ TH O LUẬN
3.1. THU THẬP MẪU MÁU B NH NHÂN VÀ TÁCH CHI T DNA TỔNG SỐ
3.1.1. ột số đặc điểm của mẫu phân tích
Mẫu máu từ các bệnh nhi có độ tuổi từ 1 tháng đến 15 tuổi, trẻ dƣới 5 tuổi (từ 1 tháng tuổi đến 5 tuổi) đƣợc nghiên cứu chiếm tỷ lệ 87,5%, từ 6 đến 15 tuổi chiếm tỷ lệ 12,5%. Trong đó, tỷ lệ nam là 57,1%, nữ là 43,9%.
Theo các dẫn liệu chẩn đoán lâm sàng bởi các bác sĩ Bệnh viện Nhi Trung ƣơng, các bệnh nhi lấy mẫu nghiên cứu đều xuất hiện các triệu chứng của bệnh thần kinh cơ (encephalomyopathy) nhƣ động kinh co giật, rối loạn chuyển hóa, chậm phát triển tinh thần vận động, tăng acid lactic máu.
3.1.2. Tách chiết tổng số của các mẫu
DN tổng số từ 200µl mẫu máu của bệnh nhân đƣợc tách theo Kit của Qiagen (Mục 2.3.1.), chế phẩm DN tổng số đƣợc điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di sản phẩm DN tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân (Hình 3.1) cho thấy các chế phẩm DN tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân đều có một băng DN rõ nét, với độ di động điện thấp (gần vạch xuất phát), chứng tỏ DN tổng số tách đƣợc đều nguyên vẹn.
M: Thang chuẩn DNA 1 kb (-): Đối chứng âm
1-5: DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân
Kết quả đo mật độ hấp thụ ánh sáng t ngoại ở 260 nm của chế phẩm DN tổng số (Phụ lục 1) cho thấy các mẫu DN đều có tỷ số 260/A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0; chứng tỏ chế phẩm DN ít lẫn protein hay RN . Hàm lƣợng DN trung bình đạt 44,5 ng/µl. Nhƣ vậy, chúng tơi đ thu đƣợc các sản phẩm DN tổng số đạt yêu cầu để tiến hành các bƣớc thí nghiệm tiếp theo.
3.2. SÀNG LỌ ĐỘT BI N GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF Ở GƯỜI VI T NAM BẰ G PHƯ G PH P P R-RFLP
3.2.1. Sàng lọc đột biến 8344G
3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8155 - 8366 bằng PCR
Để xác định sự thay đổi nucleotide G thành tại vị trí 8344 trên mtDNA chúng tôi đ tiến hành nhân bản đoạn gen có kích thƣớc 212 bp bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế bởi Trƣơng Thị Huệ và tập thể [56], nhƣ bảng 3.1.
Bảng 3.1: Trình tự mồi nhân đoạn gen 8155 - 8366
Tên mồi Vị trí gắn Trình tự mồi Chu trình nhiệt Sản phẩm PCR hững cải tiến MRAGFw 8155 – 8175 5’GGT T CTA CGG TCA ATG CTC 3’ 94ºC: 30 giây 58ºC: 30 giây 72ºC: 30 giây 212 bp Mồi Rv chứa một nucleotide không ghép cặp (T đƣợc thay thế bằng G tại vị trí 8347) để
tạo điểm cắt cho
BanII khi có đột biến MRAGRv 8366 – 8345 5’ TTT C C TGT AAA GAG GTG TGG G 3’
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2% (Hình 3.2) cho thấy sản phẩm DN khuếch đại của đoạn gen có kích thƣớc nhƣ tính tốn lý thuyết (212 bp), điều này chứng tỏ chúng tôi đ nhân bản thành công đoạn gen 8155 - 8366 từ mẫu DN tổng số của các bệnh nhân.
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm P R đoạn gen 8155 - 8366
M: Thang chuẩn DNA 100 bp
(-): Đối chứng âm (không chứa DNA khuôn)
(+): Sản phẩm PCR từ plasmid mang đột biến A8344G
1-7: Sản phẩm PCR từ mẫu DNA tổng số của bệnh nhân
3.2.1.2. Phân tích sự có mặt của đột biến A8344G bằng PCR-RFLP
Đoạn gen chứa đột biến sau khi đƣợc khuếch đại bằng PCR và kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 2% đƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn BanII.
Theo tính tốn lý thuyết, đoạn gen 8155 - 8366 không chứa đột biến sẽ bị cắt thành ba đoạn có kích thƣớc tƣơng ứng là 99 bp, 72 bp và 41 bp; trong khi đó đoạn gen có đột biến sẽ cắt thành bốn băng với kích thƣớc lần lƣợt là 99 bp, 50 bp, 41 bp và 22 bp, đột biến làm xuất hiện điểm cắt của enzyme BanII khiến băng 72 bp bị cắt thành hai băng 50 bp và 22 bp (Bảng 3.2).
Bảng 3.2: Trình tự và sản phẩm cắt của enzyme BanII
Trình tự cắt Đệm dùng cho enzyme
Sản phẩm cắt
đột biến không đột biến
GGGCC/C GAGCC/C GGGCC/C R 99 bp, 41 bp, 50 bp và 22 bp 99, 41 bp và 72 bp
Sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 12% và phát hiện đột biến dựa vào sự khác nhau về kích thƣớc của phổ băng DN dƣới ánh sáng t ngoại (Mục 2.2.6).
Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR-RF P đoạn gen 8155 - 8366 của bệnh nhân
M: Thang chuẩn DNA
(-): Sản phẩm PCR-RFLP plasmid 8344A (+):Sản phẩm PCR-RFLP plasmid 8344G 1-7: Sản phẩm PCR-RFLP của bệnh nhân
Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP (hình 3.3) cho thấy các mẫu DN nhân bản của bệnh nhân (đƣờng chạy 4 - 10) đều xuất hiện 3 băng có kích thƣớc tƣơng ứng là 99 bp, 72 bp và 41 bp, giống với sản phẩm cắt của plasmid không mang đột biến, trong khi đó đối chứng dƣơng là plasmid mang đột biến bị cắt thành 4 băng có kích thƣớc tƣơng ứng là 99 bp, 50 bp, 41 bp và 22 bp (đƣờng chạy thứ 3). Chứng tỏ,
kết quả PCR-RFLP của chúng tôi là đáng tin cậy, các mẫu bệnh nhân (nêu ở đây là 7 bệnh nhân) đƣợc sàng lọc không mang đột biến 8344G. Thực tế, chúng tôi đ sàng lọc đột biến 8344G ở 312 bệnh nhân và không phát hiện thấy bệnh nhân nào mang đột biến 8344G.
3.2.2. Sàng lọc đột biến T8356
Tiếp tục sàng lọc các đột biến thuộc hội chứng MERRF, chúng tôi tiến hành điều tra đột biến T8356C trên 182 bệnh nhân nghi mắc bệnh cơ n o ty thể (Phụ lục 1) bằng phƣơng pháp PCR-RFLP theo các bƣớc tƣơng tự nhƣ trên.
3.2.2.1. Nhân bản đoạn gen từ 8166 - 8358 bằng PCR
Đoạn gen chứa đột biến T8356C phải đƣợc khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đƣợc thiết kế bởi Trƣơng Thị Huệ và tập thể [56], nhƣ bảng 3.3, chúng tôi nhân bản đƣợc đoạn DN từ vị trí 8166 đến 8358, với kích thƣớc 220 bp.
Bảng 3.3: Trình tự mồi cho phản ứng PCR đoạn gen 8166 - 8358
Tên mồi Vị trí gắn Trình tự mồi Chu trình nhiệt Sản phẩm PCR hững cải tiến MRTCFw 8166 – 8189 5’GTC T GCTCTGA AATCTGT GG G 3’ 94ºC: 30 giây 60ºC: 30 giây 72ºC: 30 giây 220 bp Mồi Rv chứa một nucleotide không ghép cặp (G đƣợc thay thế bằng T tại vị trí 8359) để tạo điểm cắt cho
DraI khi không
đột biến MRTCRv 8385 – 8257 5’GT GT TTTAGTT GGGGCAT TTCACTT T 3’
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 2% (Hình 3.4) cho thấy chỉ có một băng DN duy nhất, kích thƣớc 220 bp đƣợc nhân lên. Ở thí nghiệm đối chứng âm khơng xuất hiện băng DN nào, chứng tỏ kết quả PCR là đúng so với những tính tốn lý thuyết.
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm P R đoạn gen 8166 - 8385
M: Thang chuẩn DNA 100 bp (-): Đối chứng âm
(+): Sản phẩm PCR plasmid mang đột biến T8356C 1-7: Sản phẩm PCR từ mẫu DNA tổng số của bệnh nhân
3.2.2.2. Phân tích sự có mặt của đột biến T8356C bằng PCR-RFLP
Sản phẩm PCR ở trên đƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn DraI. Enzyme này sẽ nhận điểm cắt có trình tự TTT/ trên đoạn gen 8166 - 8385 không chứa đột biến và cắt đoạn DN 220 bp thành hai đoạn có kích thƣớc tƣơng ứng là 192 bp và 28 bp, trong khi đó đoạn gen có đột biến khơng có trình tự này nên khơng bị cắt.
Kiểm tra sản phẩm cắt bằng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide 12% và phát hiện đột biến dựa vào sự khác nhau về kích thƣớc của phổ băng DN dƣới ánh sáng t ngoại.
Hình 3.5. Điện di sản phẩm PCR-RF P đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân
M: Thang chuẩn DNA
(+): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8356C (-): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8356T 1-7: Sản phẩm PCR-RFLP của bệnh nhân
Phổ băng điện di cho thấy tất cả sản phẩm PCR của các mẫu bệnh nhân (đƣờng chạy 2-8) đều bị cắt thành 2 đoạn DN có kích thƣớc 192 bp và 28 bp (hình 3.5) giống nhƣ tính tốn lý thuyết, chứng tỏ các mẫu bệnh nhân nghiên cứu không mang đột biến T8356C. Thực tế, chúng tôi đ điều tra 182 bệnh nhân và không phát hiện thấy trƣờng hợp nào mang đột biến T8356C.
3.2.3. Sàng lọc đột biến G8363
Nhằm xác định nguyên nhân gây ra triệu chứng lâm sàng trên những bệnh nhân đ đƣợc lấy mẫu nghiên cứu, chúng tôi tiếp tục sàng lọc đột biến G8363 trên 182 bệnh nhân có biểu hiện mắc hội chứng MERRF nói trên (Phụ lục 1).
3.2.3.1. Nhân bản đoạn gen từ 8342 - 8582
Chúng tôi dùng kỹ thuật PCR với cặp mồi bắt cặp đặc hiệu với sợi xuôi và sợi ngƣợc của đoạn mtDN nghiên cứu, đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen ty thể, nhƣ bảng 3.4, để nhân lên đoạn DN có kích thƣớc 241 bp (8342 - 8582) s dụng khuôn là mẫu DN tổng số đƣợc tách từ mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân.
Bảng 3.4: Trình tự mồi cho PCR đoạn gen 8342 - 8582
Tên mồi Vị trí gắn Trình tự mồi Chu trình nhiệt Sản phẩm PCR MRGAFw 8342 – 8361 5’G CC C CCT CTTT C G 3’ 94ºC: 30 giây 53ºC: 30 giây 72ºC: 30 giây 241 bp MRGARv 8582 – 8561 5’GCGGGT GGCCT GG TTGTGG 3’
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 2% cho kết quả (Hình 3.6) là một băng DN duy nhất có kích thƣớc 220 bp đƣợc nhân lên. Ở thí nghiệm đối chứng âm khơng xuất hiện băng DN nào, chứng tỏ kết quả PCR là đáng tin cậy so với những tính tốn lý thuyết.
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm P R đoạn gen 8342 - 8582
M: Thang chuẩn DNA 100 bp (-): Đối chứng âm
(+): Sản phẩm PCR plasmid mang đột biến G8363A 1-7: Sản phẩm PCR từ mẫu DNA tổng số của bệnh nhân
3.2.3.2. Phân tích sự có mặt của đột biến G8363A bằng PCR-RFLP
Sản phẩm PCR ở trên đƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn NlaIII. Theo tính tốn lý thuyết, enzyme NlaIII sẽ nhận biết điểm cắt GT C đoạn gen 8166 -
8385 không chứa đột biến sẽ bị cắt thành hai đoạn có kích thƣớc tƣơng ứng là 220 bp và 21 bp, trong khi đó đoạn gen có đột biến sẽ khơng bị cắt.
Sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 12% và phát hiện đột biến dựa vào sự khác nhau về kích thƣớc của phổ băng DN dƣới ánh sáng t ngoại.
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR-RF P đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân
M: Thang chuẩn DNA
(+): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8363A (-): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8363G 1-7: Sản phẩm PCR-RFLP của bệnh nhân
Phổ băng điện di trên đƣờng chạy 2-8, cho thấy tất cả các mẫu sản phẩm PCR của bệnh nhân đều bị cắt thành 2 đoạn DN 220 bp và 21 bp, chứng tỏ các mẫu bệnh nhân nghiên cứu không mang đột biến G8363 . Thực tế, chúng tôi đ điều tra 182 bệnh nhân và không phát hiện thấy trƣờng hợp nào mang đột biến G8363 .
Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp có thể áp dụng để phát hiện ra sự có mặt của đột biến 8344G trên gen ty thể nhƣ PCR-RFLP, SSCP, xác định trình tự gen, DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis), real-time PCR. Tuy nhiên, PCR-
RFLP vẫn là một kỹ thuật phân t đơn giản, hiệu quả, phù hợp cho việc sàng lọc thông dụng một lƣợng mẫu lớn. Cao và tập thể đ s dụng PCR-RFLP để sàng lọc 1.559 mẫu bệnh nhân và phát hiện 158 trƣờng hợp mang đột biến mtDN gây bệnh, tất cả các trƣờng hợp đƣợc khẳng định lại bằng xác định trình tự gen đều phù hợp với kết quả phân tích PCR-RFLP [16]. Bốn bệnh nhân Trung Quốc mang đột biến 8344G trong nghiên cứu của Yu Qi và cộng sự, đ đƣợc giải trình tự cho kết quả tƣơng tự nhƣ kết quả PCR-RFLP [44].
Trƣơng Thị Huệ và tập thể [55] đ nghiên cứu sàng lọc đột biến gen ty thể bằng phƣơng pháp PCR-RFLP trên 106 bệnh nhân Việt Nam, nhƣng cũng không