Tên mồi Vị trí gắn Trình tự mồi Chu trình nhiệt Sản phẩm PCR MRGAFw 8342 – 8361 5’G CC C CCT CTTT C G 3’ 94ºC: 30 giây 53ºC: 30 giây 72ºC: 30 giây 241 bp MRGARv 8582 – 8561 5’GCGGGT GGCCT GG TTGTGG 3’
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 2% cho kết quả (Hình 3.6) là một băng DN duy nhất có kích thƣớc 220 bp đƣợc nhân lên. Ở thí nghiệm đối chứng âm khơng xuất hiện băng DN nào, chứng tỏ kết quả PCR là đáng tin cậy so với những tính tốn lý thuyết.
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm P R đoạn gen 8342 - 8582
M: Thang chuẩn DNA 100 bp (-): Đối chứng âm
(+): Sản phẩm PCR plasmid mang đột biến G8363A 1-7: Sản phẩm PCR từ mẫu DNA tổng số của bệnh nhân
3.2.3.2. Phân tích sự có mặt của đột biến G8363A bằng PCR-RFLP
Sản phẩm PCR ở trên đƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn NlaIII. Theo tính tốn lý thuyết, enzyme NlaIII sẽ nhận biết điểm cắt GT C đoạn gen 8166 -
8385 không chứa đột biến sẽ bị cắt thành hai đoạn có kích thƣớc tƣơng ứng là 220 bp và 21 bp, trong khi đó đoạn gen có đột biến sẽ khơng bị cắt.
Sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 12% và phát hiện đột biến dựa vào sự khác nhau về kích thƣớc của phổ băng DN dƣới ánh sáng t ngoại.
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR-RF P đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân
M: Thang chuẩn DNA
(+): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8363A (-): Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid 8363G 1-7: Sản phẩm PCR-RFLP của bệnh nhân
Phổ băng điện di trên đƣờng chạy 2-8, cho thấy tất cả các mẫu sản phẩm PCR của bệnh nhân đều bị cắt thành 2 đoạn DN 220 bp và 21 bp, chứng tỏ các mẫu bệnh nhân nghiên cứu không mang đột biến G8363 . Thực tế, chúng tôi đ điều tra 182 bệnh nhân và không phát hiện thấy trƣờng hợp nào mang đột biến G8363 .
Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp có thể áp dụng để phát hiện ra sự có mặt của đột biến 8344G trên gen ty thể nhƣ PCR-RFLP, SSCP, xác định trình tự gen, DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis), real-time PCR. Tuy nhiên, PCR-
RFLP vẫn là một kỹ thuật phân t đơn giản, hiệu quả, phù hợp cho việc sàng lọc thông dụng một lƣợng mẫu lớn. Cao và tập thể đ s dụng PCR-RFLP để sàng lọc 1.559 mẫu bệnh nhân và phát hiện 158 trƣờng hợp mang đột biến mtDN gây bệnh, tất cả các trƣờng hợp đƣợc khẳng định lại bằng xác định trình tự gen đều phù hợp với kết quả phân tích PCR-RFLP [16]. Bốn bệnh nhân Trung Quốc mang đột biến 8344G trong nghiên cứu của Yu Qi và cộng sự, đ đƣợc giải trình tự cho kết quả tƣơng tự nhƣ kết quả PCR-RFLP [44].
Trƣơng Thị Huệ và tập thể [55] đ nghiên cứu sàng lọc đột biến gen ty thể bằng phƣơng pháp PCR-RFLP trên 106 bệnh nhân Việt Nam, nhƣng cũng không phát hiện đƣợc bệnh nhân nào mang đột biến 8344G và T8356C. Trong các đột biến gây nên hội chứng MERRF thì hơn 80% là 8344G, cịn đột biến T8356C và G8363 chỉ khoảng 10-20%. Trên thế giới đ có nhiều cơng bố về sàng lọc đột biến 8344G trên bệnh nhân cơ n o ty thể với kết quả đáng chú ý nhƣ nghiên cứu của Qi và cộng sự [44] điều tra đột biến gen ty thể trên 552 bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể, ở miền Bắc Trung Quốc, bằng phƣơng pháp PCR-RFLP, phát hiện 4 bệnh nhân mang đột biến 8344G (chiếm 0,72%); Cũng một nghiên cứu khác trên 124 bệnh nhân Trung Quốc nghi mắc hội chứng Leigh, Zhang và cộng sự đ phát hiện ra 2 bệnh nhân mang đột biến 8344G (1,61%) [63]; Kwon và tập thể [36], khi nghiên cứu đột biến gen ty thể trên 65 bệnh nhân Hàn Quốc, đ phát hiện đƣợc 3 trƣờng hợp mang đột biến 8344G (4,6%). Nhƣ vậy, có thể thấy tần suất phát hiện đột biến 8344G trong các nghiên cứu là rất khác nhau. Theo chúng tôi, sự khác nhau này có thể liên quan nhiều đến cách lấy mẫu điều tra ban đầu và có thể cịn những ngun nhân khác nữa cần đƣợc làm rõ.
3.3. XÂY Ự G ĐƯỜ G HUẨ ĐỂ ĐỊ H ƯỢ G ĐỘT BI 8344G BẰ G Ỹ THUẬT RE -TIME PCR
3.3.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman
3.3.1.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA
Việc thiết kế mồi cho real-time PCR dùng Taqman probe về cơ bản đƣợc thực hiện theo các nguyên tắc thiết kế mồi chung cho PCR.
Đột biến điểm 8344G (MERRF) đƣợc chúng tôi nghiên cứu định lƣợng bằng kỹ thuật real-time PCR s dụng mẫu dị Taqman khóa cầu methyl.
Kỹ thuật này đƣợc phát triển dựa vào enzyme Taq DN polymerase có hoạt tính 5’-exonuclease khi mẫu dị đƣợc gắn vào cùng sợi khuôn với mồi và phản ứng cắt này chỉ xảy ra khi gen đích đƣợc khuếch đại. Mẫu dị huỳnh quang bao gồm một đoạn nucleotide bắt cặp đặc hiệu với trình tự đích, đƣợc đánh dấu reporter và quencher. Khi mẫu dò nguyên vẹn, quencher làm hấp thu tín hiệu huỳnh quang từ reporter do sự cộng hƣởng năng lƣợng huỳnh quang (nguyên lý FRET) do khoảng cách giữa reporter và quencher khá gần nhau. Sự phân cắt của mẫu dị trong khi PCR đ giải phóng reporter làm tăng mật độ huỳnh quang và máy đo tín hiệu huỳnh quang sẽ ghi nhận đƣợc tín hiệu. Đây là phƣơng pháp phát hiện và định lƣợng đột biến nhanh, nhạy và chính xác, có giá trị khi xác định tỷ lệ đột biến mtDN thấp.
Đột biến 8344G là đột biến không đồng nhất, s dụng real-time PCR với mẫu dị Taqman thơng thƣờng đ cho tín hiệu nền cao do việc gắn không đặc hiệu của mẫu dị vào trình tự đích vì vậy khơng có giá trị để xác định tỷ lệ đột biến thấp. Vì vậy để xác định chính xác tỷ lệ đột biến 8344G thì một trong những thách thức cơ bản là thiết kế mẫu dị Taqman phải có khả năng phân biệt đƣợc các gen đích chỉ khác nhau một nucleotide. Điều này đạt đƣợc khi khoảng cách ΔTm giữa Tm của mẫu dị bắt cặp hồn tồn (mẫu dị match) và Tm của mẫu dò bắt cặp khơng hồn tồn (mẫu dị mismatch) càng lớn. Khoảng ΔTm càng lớn thì việc lựa chọn nhiệt độ bắt cặp/kéo dài trong phản ứng PCR bên trong khoảng ΔTm càng thuận lợi, mẫu dị sẽ bắt cặp chính xác hơn.
Trong thí nghiệm này, mẫu dị huỳnh quang Taqman có trình tự bổ sung với trình tự đặc hiệu trên DN đích, đầu 5’ của mẫu dị có gắn chất phát huỳnh quang (reporter) F M (495/520 nm) cho mẫu dị đặc hiệu với trình tự đột biến và HEX (535/556) cho mẫu dị đặc hiệu với trình tự khơng đột biến, cịn đầu 3’ của mẫu dị có gắn chất hấp phụ tƣơng ứng (quencher) là BFQ (Black Fluorescence Quencher).
Với mục đích tăng nhiệt độ tách chuỗi (Tm) và tính đặc hiệu của mẫu dị, mẫu dị bắt cặp đúng và bắt cặp sai cần có nhiệt độ tách chuỗi (Tm) cao hơn (Tm) của mồi khoảng 10oC và mẫu dị phải ngắn thì tác động của sự thay đổi một nucleotide càng lớn nên mẫu dị bắt cặp đặc hiệu hơn. Vì vậy, chúng tơi đ cải tiến mẫu dị Taqman dƣới dạng Taqman LN . LN là dạng acid nucleic có chứa nucleotide cải biến với cầu methyl giữa vị trí oxy 2’ và carbon 4’ của gốc đƣờng. Liên kết này đ hạn chế tính linh động của nucleotide bị khóa nên làm tăng độ bền nhiệt và độ đặc hiệu của mẫu dị trong q trình lai. Điều này làm cho mẫu dò Taqman LN hấp dẫn hơn khi s dụng để phát hiện đột biến điểm trên hệ gen ty thể.
Dựa trên ngun tắc đ phân tích, chúng tơi đ thiết kế mẫu dò Taqman LNA đặc hiệu để phát hiện đột biến 8344G bằng real-time PCR (Bảng 3.5).