3.2. Quy trình phân lập các hợp chất
Mẫu Hải miên I. echinata(10.0 kg)được chiết bằng methanol (310 lít) trên
thiết bị chiết siêu âmElmasonic S 120H (50oC, 3 h). Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gom lại và loại bỏ dung môi thu được 230 g dịch chiết methanol. Dịch chiết này được phân bố vào 3 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố vớidichloromethane (3 lần ×3 lít), sau đó cất loại bỏ dung môi lần lượt thu được các phân đoạn dichloromethane (IED, 90 g)và nước (IEW, 140g). Kiểm tra sơ bộ cho thấy các chất chủ yếu tập trung ở phân đoạn IED. Phân đoạn IEW chứa nhiều muối, các chất kéo vệt và mờ trên bản mỏng vì thế khơng được tiến hành các nghiên cứu.
Phần cặn dichloromethane (IED, 90.0 g) được hòa tan với một lượng tối thiểu dichloromethane sau đó tẩm với 225.0 g silica gel, cất quay cho đến khi bột tơi khô. Tiến hành phân đoạn hóa hỗn hợp này trên cột silica gel, rửa giải gradient bằng hệ
dung môi n-hexane/acetone với độ phân cực tăng dần (n-hexane/acetone, 100/1
IED4 (19.2 g) và IED5 (13.1 g). Phân đoạn IED2 (19.3 g) được phân tách trên cột
silica gel, rửa giải bằng hỗn hợp n-hexane/acetone (6/1, v/v) thu được 5 phân đoạn
IED2A (1.8 g), IED2B (3.7 g) và IED2C (1.3 g), IED2D (2.7 g) và IED2E (0.8 g). Phân đoạn IED2A (1.8 g)tiếp tục phân tách bằng cột silica gel, rửa giải bằng hỗn
hợp n-hexane/ethyl acetate (5/1, v/v) thu được các hợp chất IE5 (16.0 mg)vàIE6
(12.0 mg). Hợp chất IE2 (11.1 mg) và IE3 (21.0 mg)thu được từ phân đoạn IED2D
(2.7 g) sử dụng cột silica gel với hệ dung môin-hexane/acetone (2.5/1, v/v). Phân đoạn IED3(12.6 g)được phân tách bằng cột silica gel với hệ dung môi n-
hexane/acetone (6/1, v/v), thu được bốn phân đoạn nhỏ hơn IED3A (1.7 g), IED3B (1.2 g), IED3C (2.8 g) và IED3D (2.4 g). Phân đoạn IED3A (1.7 g)được tiếp tục phân tách trên cột RP-18, rửa giải bằng methanol/nước (5/1, v/v) thu được hợp chất IE1(30.0 mg).Hợp chất IE4 (16.0 mg)và IE7 (6.0 mg) thu được từ phân đoạn IED3C (2.8 g) sau khi sử dụng cột RP-18 với hỗn hợp dung môi acetone/nước (2.5/1, v/v). Hợp chất IE8 (20.0 mg) thu được từ phân đoạn IED5 (13.1 g) sau khi
3.3. Các thơng số vật lí của các hợp chất đã phân lập 3.3.1. Hợp chất IE1: (7E,12E,20Z,18S)-variabilin 3.3.1. Hợp chất IE1: (7E,12E,20Z,18S)-variabilin
Chất dầu không màu.
Độ quay cực:[ ] =‒25.9 (c=0.1, MeOH).
Công thức phân tử: C25H34O4. Khối lượng phân tử: 398.24
1
H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): XemBảng 4.1.
3.3.2. Hợp chất IE2:(12E,20Z)-8-hydroxyvariabilin
Chất dầu không màu.
Độ quay cực: [ ] =–19.6(c=0.1, MeOH).
Công thức phân tử: C25H36O5. Khối lượng phân tử: 416.26
1
H-NMR (CD3OD), 13C-NMR (CD3OD):Xem Bảng 4.2.
3.3.3. Hợp chất IE3: 8-hydroxyisovariabilin
Chất dầu không màu.
Độ quay cực: [ ] =‒13.8(c=0.1, MeOH).
Công thức phân tử: C25H36O5. Khối lượng phân tử: 416.56
HR-ESI-MS: m/z415.2483 [M‒ H]–.
Tính tốn lý thuyết cho công thức [C25H35O5]–: 415.2490
1
H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 4.3.
3.3.4. Hợp chất IE4:5α,6α-epoxy-3β,7α-dihydroxycholest-8-ene
Chất bột vơ định hình màu trắng.
Độ quay cực: [ ] : ‒65.1 (c=0.1, MeOH).
Công thức phân tử: C27H44O3. Khối lượng phân tử: 416.64
1
3.3.5. Hợp chất IE5: 5α,6α-epoxy-3β,7α-dihydroxycholest-8(14)-ene
Chất bột vơ định hình màu trắng.
Độ quay cực: [ ] =‒47.4(c=0.1, MeOH).
Công thức phân tử: C27H44O3. Khối lượng phân tử: 416.64
1
H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 4.5.
3.3.6. Hợp chất IE6: furoscalarol
Chất dầu không màu.
Độ quay cực: [ ] =+58.2 (c=0.1, MeOH).
Công thức phân tử: C27H40O4. Khối lượng phân tử: 428.29
1
H-NMR (CDCl3) và 13C-NMR (CDCl3): Xem Bảng 4.6.
3.3.7. Hợp chất IE7: 3β,5,6β-trihydroxy-cholest-7-en
Chất bột vơ định hình màu trắng.
Độ quay cực: [ ] = ‒21.1 (c=0.1, MeOH).
Công thức phân tử: C27H46O3. Khối lượng phân tử: 418.66
1
H-NMR (CDCl3+CD3OD) và 13C-NMR (CDCl3+CD3OD): Xem Bảng 4.7.
3.3.8. Hợp chất IE8:3β-hydroxycholest-5-en-7-one.
Chất dầu không màu.
Độ quay cực: [ ] = +45.1 (c=0.1, MeOH).
Công thức phân tử: C27H44O2 Khối lượng phân tử: 400.33
1
3.4. Đánh giá khả năng ức chế sự phát triểntế bào ung thư in vitro của các hợp chất chất
Tất cả các hợp chất phân lập được từ loài I. echinata được đánh giá sơ bộ
hoạt tính gây độc tế bào ung thư người ở nồng độ 100 µg/mL. Ở nồng độ này, hợp chất gây chết tế bào ung thư >50% sẽ được đánh giá ở các nồng độ khác nhau để xác định giá trị IC50.
CHƯƠNG 4- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
4.1.1. Hợp chất IE1:(7E,12E,20Z,18S)-variabilin.
Hình 4.1. Cấu trúc hóa họcvà các tương tác HMBC chính của hợp chất IE1
Hợp chất IE1 được phân lập dưới dạng chất dầu không màu. Phổ 1H-NMR của hợp chất IE1 cho biết sự xuất hiện các tín hiệu củasáu proton olefin tại δH 5.11
(t, J = 6.5 Hz), 5.17 (t, J = 7.5 Hz), 5.30 (d, J = 10.0 Hz), 6.31 (br s), 7.25 (br s) và
7.38 (br s); trong đó ba proton (δH 6.31, 7.25 và 7.38) đặc trưng cho vòng furan-3- yl, bốn nhóm methyl δH 1.08 (d, J = 7.0 Hz), 1.58 (s), 1.59 (s) và 1.76 (s).
Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất IE1 xuất hiện tín hiệu của 25 cacbon gồm: bảy cacbon không liên kết trực tiếp với hydro (δC 99.01, 126.20, 135.81, 136.52, 144.94, 164.52 và 173.46), bảy nhóm methine (δC31.87, 112.01, 115.84, 125.21, 125.60, 140.06 và143.73), bảy nhóm methylene (δC25.98, 26.81, 27.43, 29.59, 37.62, 40.71, 40.42) và bốn nhóm methyl (δC6.09, 15.90, 16.11, 21.06). Phân tích các đặc trưng trên phổ 1H- và 13C-NMR cho biết cấu trúc của hợp chất này là một variabilin, một lớp chất phổ biến và đặc trưng của loài hải miên thuộc giống
Để xác định chính xác vị trí của các nhóm chức và các liên kết đơi, chúng tôi tiến hành đo phổ HSQC và phổ HMBC. Các tương tác HMBC từ H-5 (δH 2.45) đến C-2 (δC 112.01)/C-3 (δC 126.20)/C-4 (δC 140.06)/C-6 (δC 29.59)/C-7 (δC 125.21) và từ H-9 (δH 1.59) đến C-7 (δC 125.21)/C-8 (δC 136.52)/C-10 (δC 40.71) cho phép xác định vòng furan bị thế tại C-3 và một liên kết đôi tại C-7/C-8.
Bảng 4.1. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của IE1 và hợp chất tham khảo
C δC# δCa DEPT δHa (mult., J= Hz) 1 143.9 143.73 CH 7.38 (br s) 2 112.2 112.01 CH 6.31 (br s) 3 125.7 126.20 C - 4 140.2 140.06 CH 7.25 (br s) 5 26.1 25.98 CH2 2.45 (t, 7.5) 6 29.8 29.59 CH2 2.25 (q, 7.5) 7 125.4 125.21 CH 5.17 (t, 7.5) 8 136.7 136.52 C - 9 16.3 16.11 CH3 1.59 (s) 10 40.9 40.71 CH2 2.01 (m) 11 27.6 27.43 CH2 2.10 (q, 6.5) 12 125.4 125.60 CH 5.11 (t, 6.5) 13 136.0 135.81 C - 14 16.0 15.90 CH3 1.58 (s) 15 40.6 40.42 CH2 2.01 (m) 16 27.0 26.81 CH2 1.40 (m) 17 37.8 37.62 CH2 1.38 (m) 18 32.0 31.87 CH 2.77 (m) 19 21.3 21.06 CH3 1.08 (d, 7.0) 20 115.3 115.84 CH 5.30 (d, 10.0) 21 145.7 144.94 C - 22 166.8 164.52 C - 23 97.5 99.01 C - 24 174.2 173.46 C - 25 6.2 6.09 CH3 1.76 (s) a)
Tương tác HMBC từ H-14 (δH 1.58) tới C-12 (δC 125.60)/C-13 (δC 135.81)/C- 15 (δC 40.42) cho phép khẳng định vị trí của liên kết đơi tại C-12/C-13. Vị trí của liên kết đôi tại C-20/C-21 được khẳng định bởi các tương tác HMBC từ H-19 (δH 1.08) tới C-17 (δC 37.62)/C-18 (δC 31.87)/C-20 (δC 115.84) và từ H-20 (δH 5.30) tới C-21 (δC 144.94)/C-22 (δC 164.52). Tương tác HMBC giữa H-25 (δH 1.76) và C-22 (δC 164.52)/C-23 (δC 99.01)/C-24 (δC 173.46) cho phép xác định vị trí của liên kết đơi cịn lại tại C-22/C-23. Hơn nữa, khi so sánh các số liệu phổ 13C-NMR của IE1 và variabilin [4]đo trong cùng dung mơi CD3OD thấy hồn tồn phù hợp ở các vị trí tương ứng. Hợp chất IE1có một trung tâm bất đối. Vì thế cấu hình của hợp chất này có thể xác định dựa trên so sánh độ quay cực. Thực tế, độ quay cực âm của IE1([ ] =‒25.9)giống với công bố của Balansa và cộng sự (7E,12E,20Z,18S)-
variabilin([ ] =‒24.8) đã cho phép xác định chính xác cấu trúc hóa học của hợp
chất IE1 là (7E,12E,20Z,18S)-variabilin, hợp chất này đã được phân lập từ lồiI.
Hình 4.3.Phổ 13C-NMR của hợp chất IE1
4.1.2. Hợp chất IE2: (12E,20Z)-8-hydroxyvariabilin
Hình 4.7. Cấu trúc hóa họcvà các tương tác HMBC chính của hợp chất IE2
Hợp chất IE2 được phân lập dưới dạng chất dầu không màu. Phổ 1H-NMR của hợp chất IE2 cho thấy các tín hiệu: năm proton olefin tại δH 5.17 (t, J = 7.0 Hz),
5.29 (d, J = 10.0 Hz), 6.31 (br s), 7.28 (br s) và 7.39 (br s); bốn nhóm methyl tại δH 1.08 (d, J = 6.5 Hz), 1.15 (s), 1.60 (s) và 1.76 (s).
Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất IE2 xuất hiện tín hiệu của 25 cacbon gồm: bảy cacbon không liên kết trực tiếp với hydro (δC 73.23, 98.50, 126.37, 135.74, 145.20, 165.00, 173.60), sáu nhóm methine (δC 31.79, 111.89, 115.61, 126.02, 140.08, 143.90), tám nhóm methylene (δC 23.51, 25.60, 26.19, 26.78, 37.62, 40.41, 42.17 và 42.62) và bốn nhóm methyl (δC 6.09, 15.81, 21.06 và 26.87). So sánh các tín hiệu trên phổ 1H và 13C-NMR của IE2 với IE1 nhận thấy: trên phổ 1H- NMR của IE2 vắng mặt một proton olefin (vùng trường thấp δH> 5.00) trong khi trên phổ 13C-NMR của IE2 vắng mặt hai tín hiệu của cacbon olefin (vùng δC>100.00) thay vào đó là sự xuất hiện thêm tín hiệu của cacbon ở δC 73.23 và một cacbon khác ở vùng δC 42.17. Trong đó tín hiệu tại δC 73.23 gợi ý cho sự có mặt thêm một nhóm hydroxyl trong cấu trúc của IE2 so với IE1.
Tiếp đó, các tương tác HMBC bao gồm: tương tác từ H-5 (δH 2.43) đến C-2 (δC 111.89)/C-3 (δC 126.37)/C-4 (δC 140.08)/C-6 (δC 25.60)/C-7 (δC 42.17) và tương tác từ H-9 (δ 1.15) đến C-7 (δ 42.17)/C-8 (δ 73.23)/C-10 (δ 42.62) cho phép
Bảng 4.2. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của IE2 và hợp chất tham khảo C δC# δCb δCa δHa (mult., J = Hz) C δC# δCb δCa δHa (mult., J = Hz) 1 142.7 142.76 143.90 7.39 (br s) 2 110.9 110.91 111.89 6.31 (br s) 3 124.8 124.87 126.37 - 4 138.8 138.87 140.08 7.28 (br s) 5 25.1 25.18 26.19 2.43 (t, 7.5) 6 24.4 24.42 25.60 1.63 (m) 7 41.2 41.32 42.17 1.49 (m) 8 73.9 73.93 73.23 - 9 26.5 26.61 26.87 1.15 (s) 10 41.2 41.20 42.62 1.43 (m) 11 22.5 22.58 23.51 2.00 (m) 12 124.3 124.35 126.02 5.17 (t, 7.0) 13 135.6 135.71 135.74 - 14 15.9 16.01 15.81 1.60 (s) 15 39.3 39.24 40.41 2.00 (m) 16 25.5 25.57 26.78 1.40 (m) 17 36.5 36.52 37.62 1.40 (m) 18 30.7 30.73 31.79 2.76 (m) 19 20.5 20.62 21.06 1.08 (d, 6.5) 20 115.7 115.59 115.61 5.29 (d, 10.0) 21 142.0 143.10 145.20 - 22 162.3 n.d 165.00 - 23 99.2 99.31 98.50 - 24 172.1 n.d 173.60 - 25 6.2 6.21 6.09 1.76 (s) a)
đo trong CD3OD,b)đo trong CDCl3, #C của 8-hydroxy-12E,20Z-variabilin đo trong CDCl3[5],
n.d:tín hiệu khơng quan sát được trên phổ13C-NMR.
xác định vịng furan bị thế tại vị trí C-3, và vị trí nhóm hydroxy tại C-8. Cũng giống như IE1, tương tác HMBC từ H-14 (δH 1.60) tới C-12 (δC 126.02)/C-13 (δC 135.74)/C-15 (δC 40.41) cho phép khẳng định vị trí của liên kết đơi tại C-12/C-13. Vị trí của liên kết đôi ở C-20/C-21 được khẳng định bởi các tín hiệu tương tác HMBC từ H-19 (δH 1.08) tới C-17 (δC 37.62)/C-18 (δC 31.79)/C-20 (δC 115.61) và từ H-20 (δH 5.29) tới C-21 (δC 145.20)/C-22 (δC 165.00). Tương tác HMBC giữa H- 25 (δH 1.76) và C-22 (δC 165.00)/C-23 (δC 98.50)/C-24 (δC 173.60) cho phép xác
Hơn nữa, khi so sánh số liệu phổ của IE2 với hợp chất 8-hydroxyvariabilin trong cùng dung môi đo NMR (CDCl3) cho thấy sự giống nhau giữa các vị trí tương
ứng [5] cho phép khẳng định IE2 chính là (12E,20Z)-8-hydroxyvariabilin, furanosesterterpene đã được phân lập từ lồi hải miên giống Ircinia sp.[27].
Hình 4.8.Phổ 1H-NMR của hợp chất IE2
Hình 4.12.Phổ HMBC của hợp chất IE2 4.1.3. Hợp chất IE3: 8-hydroxyisovariabilin 4.1.3. Hợp chất IE3: 8-hydroxyisovariabilin
Hợp chất IE3 thu được dưới dạng dầu không mầu và công thức phân tử được xác định là C25H36O5 dựa trên phổ HR-ESI-MS m/z 415.2483 [M‒H]– (tính tốn theo lý thuyết cho công thức [C25H35O5]–, 415.2490).
Phổ 1H-NMR của hợp chất IE3 cho thấy các tín hiệu: năm proton olefin [δH
5.07 (d, J = 10.5 Hz), 5.13 (t, J = 6.5 Hz), 6.32 (br s), 7.28 (br s) và 7.39 (br s)]
trong đó ba proton (δH 6.32, 7.28 và 7.39) đặc trưng cho vịng furan-3-yl, bốn nhóm methyl δH 1.02 (d, J = 6.5 Hz), 1.15 (s), 1.59 (s) và 1.63 (s).
Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất IE3 xuất hiện tín hiệu của 25 cacbon gồm: bảy cacbon không liên kết trực tiếp với hydro, sáu nhóm methine, tám nhóm methylene và bốn nhóm methyl. Trong đó, bốn tín hiệu cộng hưởng tại δC 111.90 (CH), 126.39 (C), 140.99 (CH) và 143.90 (CH) được quy kết cho vịng furan. Bảy tín hiệu xuất hiện ở vùng trường thấp [δC 93.32 (C), 117.96 (CH), 125.66 (CH), 136.12 (C), 148.75 (C), 178.50 (C) và 180.04 (C)] cho thấy sự có mặt của ba liên kết đơi và một nhóm carbonyl. Tín hiệu tại δC 73.24 (C) đặc trưng cho một nguyên tử cacbon bậc ba liên kết trực tiếp với oxy. Phân tích số liệu phổ 1H-và 13C-NMR của của hợp chất IE3 cho thấy các số liệu phổ của IE3 giống hợp chất 8- hydroxyvariabilin (IE2). Sự khác nhau giữa IE3 và IE2 nằm ở vùng tín hiệu của vịng lacton (từ C-20 đến C-25).
Vị trí các nhóm thế tiếp đó được xác định dựa trên phân tích phổ hai chiều HMBC. Các tương tác HMBC từ H-5 (δH 2.43) đến C-2 (δC 111.90)/C-3 (δC 126.39)/C-4 (δC 140.99)/C-6 (δC 25.61)/C-7 (δC 42.16) và tương tác HMBC từ H-9 (δH 1.15) đến C-7 (δC 42.16)/C-8 (δC 73.24)/C-10 (δC 42.71) cho phép xác định vị trí của vịng furan bị thế tại C-3, và nhóm hydroxy tại C-8. Tương tác HMBC từ H-14 (δH 1.59) tới C-12 (δC 125.66)/C-13 (δC 136.12)/C-15 (δC 40.74) cho phép khẳng định vị trí của liên kết đơi tại C-12/C-13. Vị trí của liên kết đôi thứ hai được xác định ở C-20/C-21 bởi tương tác HMBC từ H-19 (δH 1.02) tới C-17 (δC 38.71)/C-18 (δC 29.77)/C-20 (δC 117.96) và từ H-20 (δH 5.07) tới C-21 (δC 148.75)/C-22 (δC 180.04). Ngồi ra, độ chuyển dịch hóa học 13C-NMR ở vùng trường thấp của C-22
chất tham khảo 24-O-methyl-7E,12E,20Z-variabillin(IE3a) (C-22: δC 183.8) [5]. Vị
trí của liên kết đơi cịn lại tại C-23/C-24 được xác định bởi tương tác HMBC giữa H-25 (δH 1.63) và C-22 (δC 180.04)/C-23 (δC 93.32)/C-24 (δC 178.50). Tiếp đó, cấu
hình của liên kết đơi C-12/C-13 và C-20/C-21 được xác định tương ứng là 12E và 20Z bởi so sánh giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-14 (δC 15.86) và C-20 (δC
117.96) với các giá trị tương ứng trên các hợp chất đã công bố(C-20: 20Z δC 117.0, 20E δC 121.0)[5],(C-14: 12EδC ~ 16.0, 12Z δC ~ 23)[4].Từ các dẫn chứng trên, cấu trúc hóa học của IE3 được xác định là một đồng phân mới của (12E,20Z)-8-
hydroxyvariabilin (IE2) và được đặt tên là 8-hydroxyisovariabilin.
Bảng 4.3. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất IE3 và hợp chất tham khảo
C δCa,# δC@ δCa δHa (mult., J= Hz) 1 143.90 142.5 143.90 7.39 (br s) 2 111.89 111.1 111.90 6.32 (br s) 3 126.37 125.0 126.39 - 4 140.08 138.8 140.99 7.28 (br s) 5 26.19 25.0 26.19 2.43 (t, 7.0) 6 25.60 28.5 25.61 1.62 (m) 7 42.17 123.8 42.16 1.50 (m) 8 73.23 135.7 73.24 - 9 26.87 16.0 26.85 1.15 (s) 10 42.62 39.5 42.71 1.48 (m) 11 23.51 26.6 23.52 2.00 (m) 12 126.02 124.5 125.66 5.13 (t, 6.5) 13 135.74 134.7 136.12 - 14 15.81 15.8 15.86 1.59 (s) 15 40.41 39.7 40.74 2.00 (m) 16 26.78 25.7 26.85 1.45 (m) 17 37.62 36.3 38.71 1.34 (m)/1.23 (m) 18 31.79 30.8 29.77 3.68 (m) 19 21.06 20.3 22.12 1.02 (d, 6.5) 20 115.61 119.5 117.96 5.07 (d, 10.5) 21 145.20 146.7 148.75 - 22 165.00 183.8 180.07 - 23 98.50 90.1 93.32 - 24 173.60 175.6 178.50 - 25 6.09 4.0 5.84 1.63 (s) OMe 56.4 a
Hình 4.14. Các tương tác HMBC chính của hợp chất IE3