1.4. THƢ VIỆN KHÁNG THỂ BỘC LỘ TRÊN THỰC KHUẨN THẾ
1.4.3.3. Thư viện tổng hợp
Tính đặc hiệu của bất kỳ kháng thể nào phụ thuộc vào các vùng quyết định tính bổ trợ (CDR): 3 vùng CDR trên chuỗi nặng và 3 vùng CDR trên chuỗi nhẹ. Các vùng này có cấu trúc khác nhau, trong đó vùng siêu biến đổi của chuỗi nặng (VH – CDR3) là vùng có sự khác biệt nhiều nhất, ƣớc tính có khoảng 1023
trình tự VH – CDR3 khác nhau và đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành ái lực liên kết với kháng nguyên. Thƣ viện tổng hợp đƣợc tạo ra chỉ gồm các vùng VH – CDR3 có trình tự khác nhau, các vùng siêu biến đổi CDR3 của cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, đa dạng hóa tất cả các vùng siêu biến đổi CDR bằng kỹ thuật đột biến điểm hoặc error-PCR. Thƣ viện tạo ra theo phƣơng pháp này có độ đa dạng cao so với các phƣơng pháp khác [28,44].
1.4.4. Tạo thư viện kháng thể bộc lộ trên thực khuẩn thể
Một trong những ứng dụng lớn nhất của kỹ thuật phage display là phân tách đƣợc kháng thể tái tổ hợp với tính đặc hiệu cao [51]. Theo đó kỹ thuật phage display có thể đƣợc sử dụng để: (i) tạo kháng thể đơn dòng tái tổ hợp đơn chuỗi sử dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thƣ, (ii) phân tách kháng thể từ ngƣời bệnh do virus để hiểu tốt hơn về đáp ứng miễn dịch trong quá trình xâm nhiễm của virus, (iii) làm sáng tỏ tính đặc hiệu của kháng thể tự miễn và nghiên cứu sự tƣơng tác giữa các phân tử. Các đoạn kháng thể dạng Fab và scFv đều có thể đƣợc bộc lộ trên bề mặt của thực khuẩn thể M13 mà khơng mất đi ái lực và tính đặc hiệu kháng nguyên.
Về cơ bản, để tạo ra thƣ viện kháng thể cần khuếch đại các đoạn gen mã hóa chuỗi nặng và chuỗi nhẹ từ mô bạch huyết hoặc lympho bào máu ngoại biên bằng phiên mã ngƣợc và PCR. Cắt sản phẩm PCR bằng các enzyme giới hạn và tách dòng vào vector phagemid để có thể biểu hiện khi dung hợp với protein của phage [27]. Thơng thƣờng các trình tự gen tái tổ hợp mã hóa các đoạn kháng thể đƣợc nối với đầu N của gen mã hóa protein vỏ pIII và pVIII hoặc cũng có thể gắn với đầu N của protein vỏ pVII, pIX.
Để bộc lộ các peptide hoặc protein cần sử dụng bổ sung phagemid, bổ sung helper phage vào canh trƣờng vi khuẩn mang DNA phagemid để tạo ra hạt virus sử dụng trong sàng lọc. Khi nhiễm vào vi khuẩn mang phagemid, bộ gen của helper phage bắt đầu tổng hợp tất cả các protein của phage kiểu dại. Các đoạn kháng thể ở trạng thái tự nhiên gắn với protein vỏ sẽ đƣợc bộc lộ trên bề mặt các hạt phage [27]. Nhƣ vậy, sau khi sàng lọc, chọn lựa đƣợc các hạt phage mang đoạn kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên đích ta sẽ nhận đƣợc đồng thời gen mã hóa cho đoạn kháng thể này.
Chất lƣợng thƣ viện có thể đƣợc kiểm tra theo các thông số sau:
Số lƣợng các dòng chứa phagemid mang đoạn scFv.
Số lƣợng dòng biểu hiện phage mang scFv.
Số lƣợng dòng biểu hiện kháng thể scFv hòa tan.
Một số thƣ viện đã đƣợc tạo ra và sử dụng phổ biến là Nissim Library, đƣợc tạo ra trong phịng thí nghiệm của Dr.G.Winter tại Cambridge (1994), và thƣ viện của De Kruif và cộng sự (1995). Nổi bật nhất là thƣ viện tổng hợp Fab và scFv do Griffiths và cộng sự tạo ra.
Hình 11: Sơ đồ tạo thư viện kháng thể phage [theo 50].
1.4.5. Sàng lọc với thư viện kháng thể bộc lộ trên thực khuẩn thể
Nguyên tắc sàng lọc là dựa trên ái lực liên kết của kháng thể bộc lộ trên bề mặt phage với kháng nguyên đích và đƣợc tiến hành theo các bƣớc cơ bản sau: (1) Khuếch đại thƣ viện và tạo phage; (2) Hòa trộn các phage của thƣ viện với kháng nguyên đích; (3) Loại bỏ phage không gắn bằng cách rửa; (4) tách phage gắn; và (5) Tái xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ để khuếch đại các phage đã sàng lọc (hình 12). Vịng sàng lọc tiếp theo đƣợc tiến hành với thƣ viện gồm các phage đã đƣợc chọn lọc ở vòng sàng lọc trƣớc [50].
1.4.5.1. Khuếch đại thư viện và tạo phage
Trong kỹ thuật phage display, cần dùng thƣ viện có độ đa dạng càng cao càng tốt. Thông thƣờng, thƣ viện phage đƣợc giữ dƣới dạng phagemid nằm trong tế bào chủ là E.coli. Do đó, bƣớc khuếch đại này thực chất là khuếch đại tếbào E.coli. Một điều
quan trọng là kiểm tra về mặt thực nghiệm độ đa dạng của các thƣ viện trƣớc khi bắt đầu vòng sàng lọc nào [50].
1.4.5.2. Cho phage tiếp xúc với đích
Sau khi khuếch đại thƣ viện và tạo phage với các đoạn kháng thể ngẫu nhiên đƣợc biểu hiện trên bề mặt của nó, cần cho hỗn hợp phage này tiếp xúc với phân tử đích (kháng nguyên đích) nhằm sàng lọc dịng phage có ái lực liên kết cao và gắn đặc hiệu với kháng nguyên đích. Để làm đƣợc điều này, cần cố định kháng nguyên đích. Rất nhiều phƣơng pháp cố định kháng nguyên đã đƣợc phát triển cho kỹ thuật phage display (hình 12).
Hình 12: Sơ đồ thực hiện kỹ thuật phage display.
Cách đơn giản và thƣờng đƣợc sử dụng nhất là cố định các phân tử đích trên giá thể và cho dung dịch chứa phage đi qua. Một số biến thể của phƣơng pháp này đã đƣợc sử dụng thành công bao gồm cố định tên các ống hoặc phiến kính có bề mặt biến đổi hóa học, trong các cột hoặc trên bề mặt các hạt từ. Có thể cố định một số phân tử sinh học bằng phƣơng pháp hấp phụ thụ động trên ống polystyrene có bề mặt đƣợc
biến đổi thích hợp nhƣ MaxiSorp TM hoặc sử dụng đích đƣợc biotin hóa. Các phƣơng pháp sàng lọc tân tiến hơn cũng đã đƣợc áp dụng bao gồm sàng lọc với toàn bộ tế bào sống, với phân đoạn mơ cố định hoặc thậm chí trong động vật sống [24,48].
Hình 13 : Các cách tiếp cận sàng lọc thư viện khác nhau [33].
1.4.5.3. Rửa và tách
Mục tiêu chính của bƣớc rửa là loại bỏ phage không gắn trong quá trình chọn lọc.
1.4.5.4. Tái xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ
Thông thƣờng, sau khi tách phage gắn cần khuếch đại quần thể phage thu đƣợc trƣớc khi tiến hành các vòng sàng lọc tiếp theo. Tuy nhiên, một số báo cáo chỉ ra rằng sử dụng trực tiếp phage sau khi tách mà khơng khuếch đại có thể giúp giảm số phage gắn không đặc hiệu chắc chắn tồn tại trong quá trình sàng lọc. Hơn nữa, các bƣớc khuếch đại tiêu tốn khá nhiều thời gian và nếu loại bỏ chúng, có thể tự động hóa hồn tồn q trình sàng lọc.
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU. 2.1.1. Sinh phẩm 2.1.1. Sinh phẩm
- Gen mã hóa kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên UTTLT đƣợc cung cấp từ nguồn gen thiết kế thuộc phịng Cơng nghệ tế bào động vật, viện Công nghệ sinh học.
- Phagemid pHEN2.
- E.coli chủng TG1 do trung tâm Công nghệ Protein MRC Vƣơng Quốc Anh
cung cấp.
- Kháng thể cộng hợp kháng M13 (anti-M13 horseradish peroxidase-conjugate) của hãng Amersham Biosciences, USA.
- 31 mẫu máu của bệnh nhân ung thƣ tiền liệt tuyến do khoa hóa sinh, bệnh viện Bạch Mai cung cấp.
2.1.2. Hóa chất
Hóa chất sử dụng là các hóa chất tiêu chuẩn chuyên dùng cho sinh học phân tử do các hãng hóa chất có uy tín nhƣ Invitrogen, Fermentas… cung cấp và các hóa chất khác của phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ Gen – Viện Công nghệ sinh học: Cao nấm men (Yeast extract), Tryptone, Agar, Ampicillin, Tris-HCl, EDTA, NaOH, SDS, EtBr, Phenol, Chloroform, isoamyl alcohol, acid acetic, nƣớc khử ion vô trùng, BSA, Taq buffer, CaCl2…
2.1.3. Trang thiết bị
Máy ly tâm lạnh (Eppendorf, CHLB Đức).
Máy lắc ổn nhiệt.
Bể ổn nhiệt.
Tủ lạnh sâu (-200
C, -850C);
Máy Voltex (Rotolab, OSI).
Máy điện di.
Máy đo pH.
Tủ cấy vô trùng.
Pipetman các loại (Gilson, Pháp).
Máy soi chụp gel (Pharmacia) và các thiết bị khác chủ yếu thuộc phịng thí nghiệm trọng điểm, Viện Cơng nghệ Sinh học.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Nhân bản gen bằng kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phƣơng pháp PCR đƣợc hình thành dựa vào đặc tính của DNA polymerase, đó là các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt (đặc hiệu). Mồi là những đoạn DNA ngắn, nhƣng có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành một mạch mới. Khi cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, sẽ chỉ tổng hợp đƣợc đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều này có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định phải có thơng tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngƣợc (antiens primer).
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc:
- Bƣớc biến tính: Nâng nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA khuôn (thƣờng là 94 – 95oC), giữ trong 30 giây đến 1 phút để biến tính DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn.
- Bƣớc tiếp hợp: Hạ nhiệt độ xuống dƣới Tm của các mồi (thƣờng trong khoảng 40 – 60oC), giữ trong 30 giây đến 1 phút để các mồi bắt cặp với khuôn.
- Bƣớc tổng hợp: Giữ ở 72oC để kéo dài phân tử DNA từ đoạn mồi. Nhƣ vậy, sau n chu kỳ ta thu đƣợc 2n
đoạn DNA từ một đoạn DNA khuôn ban đầu. Cách tiến hành nhƣ sau:
- Trộn (mix) phản ứng PCR với đầy đủ các thành phần: DNA khuôn, cặp mồi (mồi xuôi và mồi ngƣợc), dNTP, DNA polymerase, MgCl2, dung dịch đệm, H2O khử ion 2 lần.
- Chạy máy PCR với chu trình nhiệt thích hợp.
2.2.2. Phƣơng pháp cắt và gắn DNA
Phƣơng pháp cắt DNA dựa vào khả năng nhận biết và cắt các trình tự đặc hiệu từ 4 – 7 bp của các enzyme cắt giới hạn để cắt các đoạn DNA ở vị trí xác định, tạo thành những đoạn DNA có đầu bằng hoặc đầu dính, có kích thƣớc xác định để làm ngun liệu và kiểm tra trong phản ứng gắn.
Phƣơng pháp gắn DNA dựa vào khả năng xúc tác hình thành các liên kết, nối hai đoạn axit nucleic với nhau của enzyme ligase để tạo thành DNA tái tổ hợp.Trong đề tài sử dụng các enzyme cắt, gắn: NcoI, NotI, DNA ligase. Enzyme đƣợc pha trong
dung dịch đệm với thành phần và pH mơi trƣờng thích hợp cho hoạt động của enzyme.
Cách tiến hành : Hịa đều DNA cần cắt, gắn với lƣợng thích hợp enzyme và ủ ở
nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme, các enzyme sẽ cắt hoặc gắn DNA cho ta sản phẩm mong muốn.
2.2.3. Phƣơng pháp tạo tế bào khả biến E.coli TG1.
Dƣới tác dụng của CaCl2, thành tế bào đang thời kỳ sinh trƣởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi sốc nhiệt. Sau 30 phút, tế bào sẽ biểu hiện gen kháng kháng sinh có trong đoạn DNA ngoại lai.
Quy trình tạo tế bào khả biến:
- Tế bào E.coli đƣợc ni lắc 200 vịng/phút, 37oC, qua đêm trong môi trƣờng LB lỏng.
- Pha loãng huyền dịch tế bào đã nuôi cấy theo tỷ lệ 1% trong môi trƣờng lỏng. Ni lắc 200 vịng/phút 37o
C. Sau 2 giờ tiến hành kiểm tra mật độ tế bào ở bƣớc sóng λ= 600 nm. OD600 đạt giá trị từ 0,6 đến 1 là đạt yêu cầu.
- Chuyển 1,5 ml dịch tế bào sang ống Eppendorf vô trùng. - Để trên đá 10 phút.
- Ly tâm 4000 vòng/phút, 4o
C, 5 phút. Loại dịch nổi thu cặn tế bào. - Hòa lại cặn tế bào thành huyền dịch trong 300 µl CaCl2 100 mM ở 40C. - Ly tâm 4000 vòng/phút, 40C, 5 phút. Loại dịch nổi thu cặn tế bào.
- Hòa lại cặn tế bào thành huyền dịch trong 60 µl CaCl2 100mM, giữ trong đá ít nhất 1 giờ trƣớc khi tiến hành biến nạp hoặc bảo quản ở -85o
C, trong glycerol 15 - 30% để sử dụng dần.
2.2.4. Biến nạp Plasmid vào tế bào E.coli
- Các ống tế bào khả biến đƣợc bảo quản ở -85oC đƣợc lấy ra, để trên đá ít nhất là 30 phút.
- Trộn vector tái tổ hợp với tế bào trong ống tế bào khả biến sau đó để trên đá ít nhất 30 phút. Sau đó sốc nhiệt ở 42oC trong 60 giây.
- Bổ sung 200 µl mơi trƣờng lỏng ở nhiệt độ phịng, ni lắc 220 vòng/phút, 37oC, 1 giờ.
- Hút 100 µl mẫu trải trên môi trƣờng đặc (LB) chứa kháng sinh trong đĩa petri [Thành phần môi trƣờng LB đặc: NaCl: 0,5% (g/ml), Trypton: 1% (g/ml), Cao nấm men: 0,5% (g/ml), Agar: 1,5 - 2% (g/ml)]
- Ủ đĩa ở 37oC qua đêm.
2.2.5. Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật
Các chủng vi khuẩn đƣợc ni cấy trong bình tam giác với thể tích từ 20 – 50 ml chứa 5-15ml mơi trƣờng thích hợp cho từng loại. Bình ni cấy đƣợc đặt trong máy lắc ổn nhiệt ở 370C với tốc độ lắc 220v/ph.
2.2.6. Phƣơng pháp giữ chủng
Các khuẩn lạc đơn đƣợc trải trên mơi trƣờng thạch thích hợp, ủ 370C qua đêm. Sau đó, có thể giữ đĩa thạch chứa các chủng này tại 40C trong vòng 2 tuần.
Hoạt hóa chủng vi khuẩn cần lƣu giữ trong mơi trƣờng thích hợp đến pha log, bổ sung 500μl canh trƣờng vào mỗi ống eppendorf chứa 500 μl Glycerol 100% đã khử trùng, giữ ở -700
C.
2.2.7. Phƣơng pháp điện di trên gel Agarose
DNA tích điện âm có khả năng chuyển động trong điện trƣờng theo chiều từ cực âm đến cực dƣơng. Tốc độ chuyển động của chúng trong điện trƣờng có hiệu điện thế không đổi phụ thuộc vào các yếu tố: Dạng tồn tại của DNA, kích thƣớc DNA, nồng độ agarose trong gel và hiệu điện thế giữa hai cực. Các DNA có kích thƣớc càng lớn thì chuyển động càng chậm, các DNA dạng siêu xoắn cũng chuyển động nhanh hơn DNA dạng thẳng. Trong một phạm vi nhất định của nồng độ gel agarose. Thƣờng các đoạn gen có kích thƣớc từ 300 – 10.000 bp có thể đƣợc phân tách trên gel agarose 0,8%. Đoạn gen càng nhỏ thì nồng độ agarose càng phải tăng lên.
DNA trong gel agarose thông thƣờng đƣợc nhuộm với Ethidium Bromide (EtBr) và đƣợc phát hiện bằng đèn chiếu tia UV.
Cách tiến hành
- Chuẩn bị gel agarose 0,8%: Cân agarose hịa vào dung dịch đệm TAE 1X. Đun nóng cho agarose tan hồn tồn. Để nguội xuống khoảng 50oC, đổ vào khuôn đã đặt sẵn răng lƣợc với độ dày thích hợp. Để bản gel đông và ổn định hoàn toàn trong khoảng 30 phút. Gỡ lƣợc ra, đặt bản gel vào bể điện di. Từ từ đổ ngập mặt gel bằng đệm TAE 1X.
- Tra mẫu: Lấy mẫu chứa khoảng 3 –5 µl ADN rồi trộn với đệm pha mẫu và tra vào các giếng của gel. Thang DNA chuẩn (maker) có thể đƣợc tra vào gel để làm chỉ thị phân tử.
- Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V, cƣờng độ dòng điện khoảng 400mA trong thời gian khoảng 25-30 phút. Quan sát sự di chuyển của màu để biết khi nào cần ngừng điện di.
- Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel đƣợc lấy nhẹ ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 2 µg/ml trong khoảng 10 phút. Sau đó lấy bản gel ra tráng qua nƣớc rồi quan sát và chụp ảnh dƣới ánh sáng tia tử ngoại có bƣớc sóng λ= 360 nm.
2.2.8. Xác định trình tự nucleotide của DNA bằng máy giải trình tự trên cơ sở phƣơng pháp dideoxy (Sanger)
Nguyên tắc: Sử dụng dideoxynucleotide (ddNTP) có đánh dấu huỳnh quang để làm ngừng các mạch đơn DNA đang đƣợc tổng hợp một cách ngẫu nhiên. Enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’- OH, khi gặp ddNTP (khơng có nhóm 3’- OH) thì phản ứng tổng hợp bị ngừng lại.
Kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn DNA dài ngắn khác nhau 1 nucleotide, có thể phân tách nhờ điện di trên gel polyacrylamit, phát hiện các ddNTP bằng cách đặt máy chiếu tia laze ở đầu tấm điện di, tia sáng sẽ kích thích băng điện di phát quang cho màu đặc trƣng, tín hiệu màu sẽ đƣợc truyền vào hệ thống máy điện tử, thơng tin sau đó đƣợc kết nối với máy tính đã có phần mềm chƣơng trình hóa, thơng