CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.11. Phƣơng pháp ELISA
ELISA là một kỹ thuật hóa sinh sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự có mặt của một kháng thể hoặc một kháng nguyên trong mẫu. ELISA đƣợc sử dụng nhƣ một cơng cụ phân tích trong y học và bệnh học, cũng nhƣ là một phép kiểm tra chất lƣợng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau.
Hình 14: Phản ứng ELISA
Trong ELISA, một lƣợng kháng nguyên chƣa biết đƣợc cố định trên một bề mặt, và sau đó kháng thể đặc hiệu đƣợc đƣa vào để chúng có thể liên kết với kháng nguyên. Những kháng thể này đƣợc gắn với một enzyme, và trong bƣớc cuối cùng cơ chất đƣợc thêm vào để enzyme có thể chuyển chúng thành tín hiệu phát hiện. Vì thế trong trƣờng hợp của ELISA fluorescence, khi ánh sáng với bƣớc sóng thích hợp chiếu vào mẫu, bất kỳ phức hệ kháng nguyên-kháng thể nào cũng phát sáng đủ để lƣợng kháng ngun trong mẫu có thể đo đƣợc thơng qua cƣờng độ phát sáng.
Tiến hành một phản ứng ELISA bao gồm ít nhất một kháng thể đặc hiệu với một phần kháng nguyên. Mẫu với lƣợng kháng nguyên chƣa xác định đƣợc giữ cố định trên một bề mặt rắn (thƣờng là một đĩa polystyrene) một cách không đặc hiệu (thông qua sự hút bám trên bề mặt) hoặc một cách đặc hiệu (thông qua sự bắt giữ bởi một kháng thể đặc hiệu khác với cùng kháng nguyên, trong kỹ thuật sandwich ELISA). Sau khi kháng nguyên đƣợc cố định kháng thể phát hiện sẽ đƣợc đƣa vào, hình thành phức hệ với kháng nguyên. Kháng thể phát hiện có thể đƣợc gắn cùng với một enzyme, hoặc bản thân nó có thể đƣợc nhận diện bởi một kháng thể thứ hai mà có gắn với enzyme. Giữa mỗi bƣớc khay ELISA cần đƣợc rửa bởi một dung dịch tẩy rửa để loại bỏ bất kỳ protein hoặc kháng thể nào mà khơng có liên kết đặc hiệu. Sau bƣớc rửa cuối cùng một loại cơ chất của enzyme đƣợc đƣa vào các giếng để tạo ra tín hiệu có thể nhìn thấy đƣợc, qua đó chỉ ra số lƣợng kháng nguyên có trong mẫu.
Kỹ thuật ELISA xuất hiện cho phép đánh giá sự có mặt của kháng nguyên hoặc kháng thể có trong mẫu, và là một cơng cụ hữu ích trong việc xác định nồng độ kháng thể trong huyết thanh (nhƣ đối với phép kiểm tra sự có mặt của HIV vv…). Nó cịn có nhiều ứng dụng trong cơng nghiệp thực phẩm để phát hiện những tác nhân gây dị ứng tiềm tàng trong thực phẩm nhƣ trong sữa, đậu, trứng vv…ELISA cịn có thể đƣợc sử dụng trong độc dƣợc học nhƣ là một cơ sở nhanh chóng đáng tin cậy đối với việc kiểm tra các loại thuốc nhất định.
Tiến hành phản ứng ELISA theo các bƣớc sau:
Phủ 100 μl huyết thanh vào mỗi giếng của khay thử 96 giếng, ủ ở 40C qua đêm.
Rửa 3 lần với 200 μl PBS 1X
Bổ sung vào mỗi giếng 200 μl skim milk pha trong PBS 1X (2%), ủ trong 2 giờ ở tủ ấm 37C.
Rửa 3 lần với PBS 1X
Thêm 100 μl phage vào mỗi giếng, ủ tại nhiệt độ phòng 1-2 giờ.
Rửa 3 lần với TPBS 0.01%, rửa 3 lần với PBS 1X
Bổ sung 150 μl kháng thể cộng hợp vào mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ.
Rửa 3 lần với TPBS 0.01%, rửa 3 lần với PBS 1X.
Bổ sung mỗi giếng 100 μl TMB.
Sau 10 phút bổ sung 50 μl H2SO4 1N để dừng phản ứng.