CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.7. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose
DNA tích điện âm có khả năng chuyển động trong điện trƣờng theo chiều từ cực âm đến cực dƣơng. Tốc độ chuyển động của chúng trong điện trƣờng có hiệu điện thế không đổi phụ thuộc vào các yếu tố: Dạng tồn tại của DNA, kích thƣớc DNA, nồng độ agarose trong gel và hiệu điện thế giữa hai cực. Các DNA có kích thƣớc càng lớn thì chuyển động càng chậm, các DNA dạng siêu xoắn cũng chuyển động nhanh hơn DNA dạng thẳng. Trong một phạm vi nhất định của nồng độ gel agarose. Thƣờng các đoạn gen có kích thƣớc từ 300 – 10.000 bp có thể đƣợc phân tách trên gel agarose 0,8%. Đoạn gen càng nhỏ thì nồng độ agarose càng phải tăng lên.
DNA trong gel agarose thông thƣờng đƣợc nhuộm với Ethidium Bromide (EtBr) và đƣợc phát hiện bằng đèn chiếu tia UV.
Cách tiến hành
- Chuẩn bị gel agarose 0,8%: Cân agarose hòa vào dung dịch đệm TAE 1X. Đun nóng cho agarose tan hồn tồn. Để nguội xuống khoảng 50oC, đổ vào khuôn đã đặt sẵn răng lƣợc với độ dày thích hợp. Để bản gel đông và ổn định hoàn toàn trong khoảng 30 phút. Gỡ lƣợc ra, đặt bản gel vào bể điện di. Từ từ đổ ngập mặt gel bằng đệm TAE 1X.
- Tra mẫu: Lấy mẫu chứa khoảng 3 –5 µl ADN rồi trộn với đệm pha mẫu và tra vào các giếng của gel. Thang DNA chuẩn (maker) có thể đƣợc tra vào gel để làm chỉ thị phân tử.
- Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V, cƣờng độ dòng điện khoảng 400mA trong thời gian khoảng 25-30 phút. Quan sát sự di chuyển của màu để biết khi nào cần ngừng điện di.
- Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel đƣợc lấy nhẹ ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 2 µg/ml trong khoảng 10 phút. Sau đó lấy bản gel ra tráng qua nƣớc rồi quan sát và chụp ảnh dƣới ánh sáng tia tử ngoại có bƣớc sóng λ= 360 nm.
2.2.8. Xác định trình tự nucleotide của DNA bằng máy giải trình tự trên cơ sở phƣơng pháp dideoxy (Sanger)
Nguyên tắc: Sử dụng dideoxynucleotide (ddNTP) có đánh dấu huỳnh quang để làm ngừng các mạch đơn DNA đang đƣợc tổng hợp một cách ngẫu nhiên. Enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’- OH, khi gặp ddNTP (khơng có nhóm 3’- OH) thì phản ứng tổng hợp bị ngừng lại.
Kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn DNA dài ngắn khác nhau 1 nucleotide, có thể phân tách nhờ điện di trên gel polyacrylamit, phát hiện các ddNTP bằng cách đặt máy chiếu tia laze ở đầu tấm điện di, tia sáng sẽ kích thích băng điện di phát quang cho màu đặc trƣng, tín hiệu màu sẽ đƣợc truyền vào hệ thống máy điện tử, thơng tin sau đó đƣợc kết nối với máy tính đã có phần mềm chƣơng trình hóa, thơng tin về màu đƣợc đọc thành trình tự bazow tƣơng ứng, từ đó đƣa ra trình tự nucleotide.
Cách tiến hành:
- Thực hiện phản ứng PCR.
- Chạy máy giải trình tự và xử lý kết quả.
2.2.9. Chuẩn bị thƣ viện phage.
- Ni các dịng tế bào đã chọn đƣợc từ đĩa biến nạp trên môi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicillin (nồng độ cuối 100 µg/ml), ni lắc ở 370C, 200 vịng/phút, qua đêm.
- Nuôi 2 ml dịch nuôi qua đêm trong 15 ml môi trƣờng 2xTY chứa ampicillin (100 µg/ml), ni lắc ở 370C, 200 vịng/phút trong 2 giờ đến khi OD600 = 0,5 – 0,6.
- Nhiễm 120 µl helper phage vào mỗi ống (M13K07). - Ủ trong nƣớc 370C trong 30 phút (không lắc).
- Ly tâm 3300g , 10 phút, thu cặn tế bào.
- Huyền phù cặn trong 80 ml 2xTy + 100 µg/ml Ampicillin + 25 µg/ml kanamycine. - Ủ lắc 300C qua đêm.
2.2.10. Bộc lộ mảnh kháng thể scFv trên phage M13.
- Ly tâm canh trƣờng từ bƣớc trên ở 3300g trong 30 phút
- Thu dịch nổi chứa phage, đặt trong ống ly tâm mới và kết tủa các hạt bằng cách cho thêm 1/5 thể tích PEG/NaCl (20% + 2,5M). Trộn đều và để tối thiểu 1 giờ ở 40
C. - Ly tâm 10800g trong 30 phút.
- Huyền phù cặn trong 20 ml nƣớc, cho 4ml PEG/NaCl, trộn đều và để 1 giờ ở 40C.
- Ly tâm 10800g trong 30 phút, loại dịch. Huyền phù cặn trong 2,5 ml PBS. - Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút để loại hầu hết các mảnh vụn tế bào cịn sót lại.
2.2.11. Phƣơng pháp ELISA
ELISA là một kỹ thuật hóa sinh sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự có mặt của một kháng thể hoặc một kháng nguyên trong mẫu. ELISA đƣợc sử dụng nhƣ một cơng cụ phân tích trong y học và bệnh học, cũng nhƣ là một phép kiểm tra chất lƣợng trong nhiều ngành cơng nghiệp khác nhau.
Hình 14: Phản ứng ELISA
Trong ELISA, một lƣợng kháng nguyên chƣa biết đƣợc cố định trên một bề mặt, và sau đó kháng thể đặc hiệu đƣợc đƣa vào để chúng có thể liên kết với kháng nguyên. Những kháng thể này đƣợc gắn với một enzyme, và trong bƣớc cuối cùng cơ chất đƣợc thêm vào để enzyme có thể chuyển chúng thành tín hiệu phát hiện. Vì thế trong trƣờng hợp của ELISA fluorescence, khi ánh sáng với bƣớc sóng thích hợp chiếu vào mẫu, bất kỳ phức hệ kháng nguyên-kháng thể nào cũng phát sáng đủ để lƣợng kháng ngun trong mẫu có thể đo đƣợc thơng qua cƣờng độ phát sáng.
Tiến hành một phản ứng ELISA bao gồm ít nhất một kháng thể đặc hiệu với một phần kháng nguyên. Mẫu với lƣợng kháng nguyên chƣa xác định đƣợc giữ cố định trên một bề mặt rắn (thƣờng là một đĩa polystyrene) một cách không đặc hiệu (thông qua sự hút bám trên bề mặt) hoặc một cách đặc hiệu (thông qua sự bắt giữ bởi một kháng thể đặc hiệu khác với cùng kháng nguyên, trong kỹ thuật sandwich ELISA). Sau khi kháng nguyên đƣợc cố định kháng thể phát hiện sẽ đƣợc đƣa vào, hình thành phức hệ với kháng nguyên. Kháng thể phát hiện có thể đƣợc gắn cùng với một enzyme, hoặc bản thân nó có thể đƣợc nhận diện bởi một kháng thể thứ hai mà có gắn với enzyme. Giữa mỗi bƣớc khay ELISA cần đƣợc rửa bởi một dung dịch tẩy rửa để loại bỏ bất kỳ protein hoặc kháng thể nào mà khơng có liên kết đặc hiệu. Sau bƣớc rửa cuối cùng một loại cơ chất của enzyme đƣợc đƣa vào các giếng để tạo ra tín hiệu có thể nhìn thấy đƣợc, qua đó chỉ ra số lƣợng kháng nguyên có trong mẫu.
Kỹ thuật ELISA xuất hiện cho phép đánh giá sự có mặt của kháng nguyên hoặc kháng thể có trong mẫu, và là một cơng cụ hữu ích trong việc xác định nồng độ kháng thể trong huyết thanh (nhƣ đối với phép kiểm tra sự có mặt của HIV vv…). Nó cịn có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm để phát hiện những tác nhân gây dị ứng tiềm tàng trong thực phẩm nhƣ trong sữa, đậu, trứng vv…ELISA cịn có thể đƣợc sử dụng trong độc dƣợc học nhƣ là một cơ sở nhanh chóng đáng tin cậy đối với việc kiểm tra các loại thuốc nhất định.
Tiến hành phản ứng ELISA theo các bƣớc sau:
Phủ 100 μl huyết thanh vào mỗi giếng của khay thử 96 giếng, ủ ở 40C qua đêm.
Rửa 3 lần với 200 μl PBS 1X
Bổ sung vào mỗi giếng 200 μl skim milk pha trong PBS 1X (2%), ủ trong 2 giờ ở tủ ấm 37C.
Rửa 3 lần với PBS 1X
Thêm 100 μl phage vào mỗi giếng, ủ tại nhiệt độ phòng 1-2 giờ.
Rửa 3 lần với TPBS 0.01%, rửa 3 lần với PBS 1X
Bổ sung 150 μl kháng thể cộng hợp vào mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ.
Rửa 3 lần với TPBS 0.01%, rửa 3 lần với PBS 1X.
Bổ sung mỗi giếng 100 μl TMB.
Sau 10 phút bổ sung 50 μl H2SO4 1N để dừng phản ứng.
CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nhân bản gen mã hóa mảnh kháng thể scFv bằng PCR.
Để có thể thu đƣợc gen mã hóa mảnh kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA của bệnh ung thƣ tiền liệt tuyến đủ cho việc thiết kế vector biểu hiện, chúng tôi thực hiện phản ứng nhân gen bằng kỹ thuật PCR với 2 mồi đặc hiệu: TTLF: 5’- GGCCCCATGGCCATTGCGGGCCTG – 3’
TTLR: 5’- GATGTGCGGCCGCACGTTTGATTTC – 3’
Cặp mồi này đƣợc gắn luôn 2 vị trí nhận biết của enzyme giới hạn NcoI và NotI
nhằm mục đích sau khi nhân dịng đƣợc đoạn gen mong muốn, chúng tơi có thể tiến hành xử lý với enzyme giới hạn để đƣa vào vector biểu hiện một cách dễ dàng.
Phản ứng PCR chúng tôi tiến hành gồm những thành phần: Taq buffer 10X 2,5 μl dNTP (10 mM) 2 μl MgCl2 (25 mM) 2,5 μl Primer F (10 pM) 0,8 μl Primer R (10 pM) 0,8 μl DNA template 0,5 μl
Taq DNA polymerase (5 U/μl) 0,2 μl
H2O 15,7 μl
Tổng thể tích 25 μl
Hình 15: Điện di sản phẩm PCR
M: Marker DNA 1kb ( Fermentas), G1: Sản phẩm PCR.
Hình ảnh điện di trên cho thấy sản phẩm PCR thu đƣợc khá đặc hiệu, kết quả phù hợp với tính tốn lý thuyết, băng thu đƣợc có kích thƣớc nhƣ mong muốn là 496 bp. Nhƣ vậy, có thể khẳng định chúng tơi đã nhân bản thành cơng gen scFv mã hóa cho
mảnh kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA của UTTLT, gen thu đƣợc mang hai vị trí cắt của hai enzyme giới hạn NcoI và NotI.
3.2. Kết quả tạo vector tái tổ hợp pHEN2 - scFv
Từ nguồn sản phẩm PCR thu đƣợc ở trên, chúng tôi đã sử dụng các enzyme giới hạn NotI và NcoI xử lý chúng để tạo hai đầu dính giúp cho việc gắn gen vào phagemid đƣợc dễ dàng hơn. Tƣơng tự, phagemid pHEN2 cũng đƣợc xử lý với hai enzyme trên tạo hai đầu dính bổ sung. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ trong bể ổn nhiệt 37oC trong thời gian 16 giờ. Sau đó, sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel agarose và tiến hành tinh sạch từ gel để thu đƣợc gen scFv và phagemid pHEN2 có hai đầu dính đảm bảo cho phản
ứng nối gen.
Thành phần phản ứng cắt nhƣ sau: 500 bp
Thành phần Thể tích (µl) Phagemid pHEN2 (scFv) 20 Buffer 4 NcoI 2 NotI 2 H2O 12 Tổng thể tích 40
Sau đó nhờ enzyme nối T4 ligase nối hai đầu dính của đoạn gen scFv vào vector mở vòng pHEN2. Thực hiện biến nạp bằng phƣơng pháp sốc nhiệt vector tái tổ hợp pHEN2 vào vi khuẩn E.coli chủng TG1 theo quy trình 2.2.4 nhƣ đã trình bày ở trên. Phagemid pHEN2 có chứa đoạn gen kháng kháng sinh ampicillin nên khi vector này đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E.coli thành cơng thì những tế bào chứa phagemid sẽ
sống sót trên mơi trƣờng có ampicillin. Cịn những tế bào không nhận vector sẽ không mọc đƣợc trên đĩa LB có bổ sung ampicillin.
Hình 16: Kết quả biến nạp sản phẩm nối ghép giữa phagemid pHEN2 với gen
scFv vào E.coli chủng TG1
E.coli TG1 thành công. Tuy nhiên, sự xuất hiện của các khuẩn lạc này mới chỉ khẳng
định đƣợc trong tế bào vi khuẩn TG1 thu đƣợc có chứa phagemid pHEN2 cịn pHEN2 đã chứa gen scFv hay chƣa thì chƣa xác định đƣợc. Do đó, chúng tơi tiến hành kiểm tra chọn dịng tế bào TG1 chứa phagemid tái tổ hợp 3.3. Chọn dòng phagemid tái tổ
hợp mang gen scFv đặc hiệu UTTLT
Để tiến hành chọn dòng phagemid tái tổ hợp mang gen scFv đặc hiệu UTTLT chúng tôi sử dụng phƣơng pháp PCR khuẩn lạc. 7 khuẩn lạc đƣợc chọn để tiến hành PCR cùng phagemid gốc với cặp mồi của vector pHEN2 có tên là LabF/R và chu trình nhiệt phù hợp. Cặp mồi LabF/R đƣợc thiết kế nằm về hai phía của vùng cắt gắn đa điểm, nếu vector gốc chƣa gắn thêm đoạn gen ngoại lai thì sau khi PCR với mồi Lab sẽ thu đƣợc sản phẩm khoảng 200 bp, nếu vector gắn thêm đoạn gen ngoại lai thì sản phẩm PCR thu đƣợc sẽ có kích thƣớc bằng kích thƣớc của gen ngoại lai cộng với 200 bp. Do vậy, nếu khuẩn lạc nào chứa phagemid tái tổ hợp pHEN2-scFv thì sản phẩm PCR từ khuẩn lạc đó khi điện di kiểm tra trên gen agarose sẽ cho băng có kích thƣớc là 700 bp.
Hình 17: Sơ đồ vector pHEN2.
Thành phần Thể tích (µl) Taq buffer 10X 2,5 dNTP 2 LAB F 1 LAB R 1 template 2
Taq DNA polymerase 0,3
H2O 16,2
Tổng thể tích 25
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR đƣợc thể hiện trên hình 18:
Hình 18: Kết quả PCR từ khuẩn lạc chọn dòng chủng TG1
chứa phagemid tái tổ hợp pHEN2-scFv G1-7: Các khuẩn lạc từ 1-7 M : Marker DNA 1kb ( Fermentas).
Kết quả điện di trên hình 18 cho thấy các khuẩn lạc 1,2,3,5 cho băng điện di có kích thƣớc mong muốn là khoảng 700bp, trong khi 3 khuẩn lạc 4,6,7 khơng nhìn thấy băng. Điều đó chứng tỏ khả năng 4 dịng tế bào 1,2,3,5 đều chứa phagemid tái tổ hợp
1 2 3 4 5 6 7 M
phagemid và xác định trình tự, đồng thời kiểm tra gen mã hóa scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA của UTTLT gắn vào pHEN2 có đúng chiều và khung đọc hay khơng.
3.4. Xác định trình tự gen scFv trong phagemid tái tổ hợp pHEN2/scFv.
Trong 4 dịng TG1 có khả năng mang phagemid tái tổ hợp đã xác định sơ bộ bằng phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc, chúng tôi chọn khuẩn lạc số 2 cho băng sắc nét nhất để nhân ni trong mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicilline (100 μg/ml) và tách chiết phagemid. Kết quả tách chiết phagemid tái tổ hợp đƣợc thể hiện trên hình 19.
Hình 19. Kết quả tách chiết phagemid tái tổ hợp
Giếng 1,2: Các phagemid tách chiết từ khuẩn lạc số 2.
Phagemid thu đƣợc đƣợc tiến hành xác định trình tự với mồi LabF sử dụng kit “Big Dye Terminator sequencing kit” (ABI, Mỹ) và thực hiện trên máy xác định trình tự ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer theo phƣơng pháp Sanger và cs. Kết quả thu đƣợc đƣợc thể hiện trên hình 20.
1 ATCCTATTGC CTACGGCAGC CGCTGGATTG TTATTACTCG CGGCCCAGCC 51 GGCCATGGCC ATTGCGGGCC TGGCGACCCC GGGCTGGAGC CATTGGCTGG
101 CGCTGACGCC ATGGCCCAGG TGCAGCTGCA GGTCGACCTC GAGTGGTGGA 151 GGCGGTTCAG GCGGAGGTGG CTCTGGCGGT AGTGCACTTG AGATTGTGAT 201 GACCCAGACT CCACTCTCCT CACCTGTCAC CCTTGGACAG CCGGCCTCCA 251 TCTCCTGCAG GTCTAGTCAA AGCCTCGTAC ACAGTGATGG AAACACCTAC 301 TTGAGTTGGC TTCAGCAGAG GCCAGGCCAG CCTCCAAGAC TCCTAATTTA 351 TAAGATTTCT AACCGGTTCT CTGGAGTGCC AGATAGGTTC AGTGGCAGCG 401 GGTCAGGGAC AGATTTCACA CTGAAAATCA GCAGGGTGGA AGCTGAGGAT 451 GTCGGGGTTT ATTACTGCAT GCAAGCTGCA CAATTTCGCC GTTCTACGTT 501 CGGCCAGGGG ACCAAGCTGG AAATCAAACG TGCGGCCGCA CTCGAGCACC
551 ACCACCACCA CCACTGA
Hình 20: Trình tự gen scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA của UTTLT
Các chữ màu đỏ: trình tự gen scFv; chữ màu đen: 1 phần trình tự phagemid pHEN2
Từ trình tự gen thu đƣợc để tiến hành kiểm tra xem gen scFv gắn vào phagemid pHEN2 đã đúng chiều đúng khung đọc hay chƣa, chúng tôi tiến hành suy diễn ra trình tự amino acid bằng phần mềm chuyên dụng, kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
1 ILLPTAAAGL LLLAAQPAMA IAGLATPGWS HWLALTPWPR CSCRSTSSGG
51 GGSGGGGSGG SALEIVMTQT PLSSPVTLGQ PASISCRSSQ SLVHSDGNTY 101 LSWLQQRPGQ PPRLLIYKIS NRFSGVPDRF SGSGSGTDFT LKISRVEAED 151 VGVYYCMQAA QFRRSTFGQG TKLEIKRAAA LEHHHHHH*
Hình 21: Trình tự amino acid suy diễn
Kết quả thu đƣợc giúp chúng tôi khẳng định chắc chắn rằng gen mã hóa cho scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA đã đƣợc gắn vào phagemid pHEN2 theo chiều đúng khung đọc đảm bảo cho quá trình bộc lộ scFv trên bề mặt phage.
3.5. Kết quả bộc lộ mảnh kháng thể scFv trên phage M13
E.coli chủng TG1 chứa phagemid-scFv đã chọn đƣợc ở trên đƣợc nhân nuôi ở 37oC đến khi đạt OD600 = 0,5 và sau đó đƣợc hiễm helper phage M13 vào để hỗ trợ việc hình thành phage-scFv một cách hồn chỉnh theo phƣơng pháp 2.2.10. Một trong những điểm mạnh của kỹ thuật phage display là mối tƣơng quan giữa kiểu gen và kiểu hình, trong đó bộ gen của phage thực chất là phagemid vector (pHEN2 vector). Các
đoạn kháng thể (trong trƣờng hợp này là các đoạn scFv) sẽ đƣợc gắn vào vị trí đa nối nằm trƣớc gen mã hóa protein vỏ pIII của phage. Do đó, các đoạn scFv này sẽ đƣợc biểu hiện trên vỏ của phage, gắn với protein vỏ pIII. Vì vậy, để kiểm tra kết quả bộc lộ mảnh kháng thể scFv trên bề mặt phage có đƣợc hay khơng ta chỉ cần thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi LABF và LABR đƣợc thiết kế nằm hai bên sƣờn vùng mã