CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Xác định trình tự gen scFv trong phagemid tái tổ hợp
Trong 4 dịng TG1 có khả năng mang phagemid tái tổ hợp đã xác định sơ bộ bằng phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc, chúng tôi chọn khuẩn lạc số 2 cho băng sắc nét nhất để nhân ni trong mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicilline (100 μg/ml) và tách chiết phagemid. Kết quả tách chiết phagemid tái tổ hợp đƣợc thể hiện trên hình 19.
Hình 19. Kết quả tách chiết phagemid tái tổ hợp
Giếng 1,2: Các phagemid tách chiết từ khuẩn lạc số 2.
Phagemid thu đƣợc đƣợc tiến hành xác định trình tự với mồi LabF sử dụng kit “Big Dye Terminator sequencing kit” (ABI, Mỹ) và thực hiện trên máy xác định trình tự ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer theo phƣơng pháp Sanger và cs. Kết quả thu đƣợc đƣợc thể hiện trên hình 20.
1 ATCCTATTGC CTACGGCAGC CGCTGGATTG TTATTACTCG CGGCCCAGCC 51 GGCCATGGCC ATTGCGGGCC TGGCGACCCC GGGCTGGAGC CATTGGCTGG
101 CGCTGACGCC ATGGCCCAGG TGCAGCTGCA GGTCGACCTC GAGTGGTGGA 151 GGCGGTTCAG GCGGAGGTGG CTCTGGCGGT AGTGCACTTG AGATTGTGAT 201 GACCCAGACT CCACTCTCCT CACCTGTCAC CCTTGGACAG CCGGCCTCCA 251 TCTCCTGCAG GTCTAGTCAA AGCCTCGTAC ACAGTGATGG AAACACCTAC 301 TTGAGTTGGC TTCAGCAGAG GCCAGGCCAG CCTCCAAGAC TCCTAATTTA 351 TAAGATTTCT AACCGGTTCT CTGGAGTGCC AGATAGGTTC AGTGGCAGCG 401 GGTCAGGGAC AGATTTCACA CTGAAAATCA GCAGGGTGGA AGCTGAGGAT 451 GTCGGGGTTT ATTACTGCAT GCAAGCTGCA CAATTTCGCC GTTCTACGTT 501 CGGCCAGGGG ACCAAGCTGG AAATCAAACG TGCGGCCGCA CTCGAGCACC
551 ACCACCACCA CCACTGA
Hình 20: Trình tự gen scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA của UTTLT
Các chữ màu đỏ: trình tự gen scFv; chữ màu đen: 1 phần trình tự phagemid pHEN2
Từ trình tự gen thu đƣợc để tiến hành kiểm tra xem gen scFv gắn vào phagemid pHEN2 đã đúng chiều đúng khung đọc hay chƣa, chúng tôi tiến hành suy diễn ra trình tự amino acid bằng phần mềm chuyên dụng, kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
1 ILLPTAAAGL LLLAAQPAMA IAGLATPGWS HWLALTPWPR CSCRSTSSGG
51 GGSGGGGSGG SALEIVMTQT PLSSPVTLGQ PASISCRSSQ SLVHSDGNTY 101 LSWLQQRPGQ PPRLLIYKIS NRFSGVPDRF SGSGSGTDFT LKISRVEAED 151 VGVYYCMQAA QFRRSTFGQG TKLEIKRAAA LEHHHHHH*
Hình 21: Trình tự amino acid suy diễn
Kết quả thu đƣợc giúp chúng tôi khẳng định chắc chắn rằng gen mã hóa cho scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA đã đƣợc gắn vào phagemid pHEN2 theo chiều đúng khung đọc đảm bảo cho quá trình bộc lộ scFv trên bề mặt phage.