Nhiệt độ (0C) 28 37 Độ đậm của vạch đặc hiệu ++++ ++ Nồng độ IPTG(mM) 0,3 0,6 0,8 1 Độ đậm của vạch đặc hiệu + ++ ++ +++ Thời gian cảm ứng (h) 2 3 4 5 6 Độ đậm của vạch đặc hiệu + +++ +++ ++ ++ Ghi chú: +: Mờ ++: Rõ và mảnh +++: Rõ và đậm ++++: Rõ và rất đậm.
Như vậy, điều kiện tối ưu để cảm ứng biểu hiện protein là ở 280C, nồng độ chất cảm ứng 1 mM, thời gian cảm ứng 3 giờ.
3.2.4. Tinh sạch protein ESAT6/CFP10
Theo thiết kế vector biểu hiện pET21a+/CFP10-ESAT6, khi protein đích được tổng hợp nó sẽ nối thêm 6 axit amin histidin ở phần –COOH. Đây là một đặc điểm thuận lợi cho việc tinh sạch sản phẩm.
Phương pháp tinh sạch bằng cột Histag dựa vào liên kết ái lực giữa ion niken (Ni2+) với vòng imidazol của histidin. Khi các axit amin histidin ở gần nhau thì liên kết giữa chúng với các ion niken càng mạnh. Protein tái tổ hợp do gen seb mã hóa có đi His-tag với 6 axit amin histidin liên tục sẽ liên kết đặc hiệu với ion niken. Các phân tử protein trong tế bào được tổng hợp ra do khơng có đi His-tag nên sẽ không gắn được với ion niken. Mặt khác, các ion niken trong cột lại được liên kết với các hạt Sepharose bằng một phức càng cua nên protein tái tổ hợp sẽ không bị rửa trôi bằng các đệm rửa như các protein khác. Protein tái tổ hợp được giữ lại trên cột sẽ được tách ra khi cho qua dung dịch đệm có chứa nồng độ imidazol thích hợp. Việc thu mẫu được tiến hành theo từng phân đoạn liên tục để kiểm tra protein ngoại lai bắt đầu được tách ra khỏi cột từ phân đoạn nào và kết thúc ở phân đoạn nào.
Trong quá trình tinh sạch và thu mẫu protein trên, chúng tôi tiến hành kiểm tra sản phẩm trước và sau khi tinh sạch trên gel polyacrylamide 12%.
Kết quả tinh sạch protein ESAT6/CFP10 được thể hiện trong hình 3.10.
Hình 3.10. Kết quả tinh sạch protein tái tổ hợp. (M: Thang protein chuẩn; 1: Protein ESAT6/CFP10). (M: Thang protein chuẩn; 1: Protein ESAT6/CFP10).
Protein sau khi tinh sạch có kích thước 24,8 kDa tương ứng với kích thước protein ESAT6/CFP10 theo tính tốn lí thuyết.
Như vậy, chúng tôi đã tinh sạch protein ESAT6/CFP10 thành công. 3.2.5. Kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm
Protein tái tổ hợp CFP10/ESAT6 sau khi tinh sạch được tiến hành kiểm tra nồng độ endotoxin trong sản phẩm bằng ToxinEraser Endotoxin Removal Kit. Cat. No. L00338 (GenScript). Kết quả được trình bày ở bảng 3.