(a)- 1: Chứng âm (b)- 1: Gen mã hóa protein CFP10
2: Gen mã hóa protein ESAT6/CFP10. 2: Gen mã hóa protein ESAT6
Kết quả trên hình 3.2 cho thấy sản phẩm nối 2 gen ESAT6 và CFP10 có kích thước
khoảng 645bp.
3.1.2.2. Kết quả tách dịng
Sản phẩm PCR có độ dài 645bp khuếch đại với cặp mồi P1; P4 mã hóa cho protein ESAT6/CFP10 của vi khuẩn lao, được tinh khiết (PCR Purification Kit-QIAGEN),
sau đó được chuyển vào plasmid (pGEMT@T-Vector system; Cat.A1360;
Promega).
352bp
338bp 645 bp
Biến nạp plasmid có chứa đoạn ADN 645bp vào tế bào khả biến, sử dụng phương pháp sốc nhiệt 420C trong 50 giây, sau đó tế bào vi khuẩn đã biến nạp này được cấy trong đĩa thạch LB agar có bổ sung ampicilline, Xgal, IPTG, 370C qua đêm (Hình 3.3). Kết quả cho thấy khuẩn lạc màu trắng là tế bào khả biến chứa plasmid mang ADN lạ, còn khuẩn lạc màu xanh là tế bào khả biến đã nhận plasmid nhưng plasmid đó khơng mang ADN lạ. Trên plasmid mang một phần gen lacZ, xen vào giữa lacZ là một polylinker, vùng này cho phép gắn xen bất kỳ một đoạn ADN lạ nào. Sự có mặt của gen lacZ tạo thuận lợi cho việc phát hiện vector tái tổ hợp bằng cách quan sát màu khuẩn lạc. Gen lacZ mã hóa cho enzym β-galactosidase có tác dụng bẻ gãy β-galactoside thành các đường, gen lacZ sẽ làm cho các vi khuẩn sử dụng làm tế bào chủ có kiểu hình lacZ- thành lacZ+. Khi vi khuẩn lacZ+ được nuôi trên môi trường bổ sung IPTG là chất cảm ứng của operon lactoza và Xgal là cơ chất của β-galactosidase, Xgal sẽ bị β-galactosidase chuyển thành màu xanh, do đó các dịng vi khuẩn sẽ có màu xanh. Trong plasmid tái tổ hợp, gen lacZ bị cắt ra để gắn xen đoạn ADN cần tạo dịng vào, do đó gen này bị bất hoạt, khơng được dịch mã thành enzym. Lúc đó vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp sẽ khơng có màu xanh mà xuất hiện màu trắng.