Tế bào khả biến mang plasmid chứa ADN lạ tạo khuẩn lạc màu trắng, tế bào khả biến mang plasmid không chứa AND lạ tạo khuẩn lạc màu xanh.
Sau khi tinh khiết (plasmid Mini Extraction Kit-QIAGEN), tất cả plasmid tái tổ hợp được kiểm tra theo phương pháp PCR sử dụng plasmid tái tổ hợp làm khuôn với cặp mồi P1;P4.
645bp
Hình 3.4. Sản phẩm PCR được khuếch đại trên các plasmid tái tổ hợp, sử dụng cặp mồi P1, P4.
(M: Thang ADN chuẩn 100bp; 1;3-14: plasmid tái tổ hợp ; 2: Chứng âm).
Sản phẩm PCR có độ dài khoảng 645bp tương ứng kích thước gen ESAT6/CFP10 chứng tỏ các plasmid tái tổ hợp được kiểm tra đều chứa gen ESAT6/CFP10 nên các plasmid này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Như vậy, chúng tôi đã tách dịng thành cơng dịng tế bào mang plasmid chứa gen mã hóa cho protein ESAT6/CFP10.
3.1.2.3. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen ESAT6-CFP10 3.1.2.3.1. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen pET21a+
-Chuẩn bị vector biểu hiện pET21a+
Muốn gen đích biểu hiện thành protein cần thiết kế gen vào vector mang các cấu trúc cần thiết cho quá trình phiên mã và dịch mã. Các vector này được gọi là vector
biểu hiện. Các trình tự quan trọng nhất trợ giúp cho quá trình biểu hiện gen là: (1) promotor, (2) terminator, (3) trình tự điều hịa (regulator).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng vector pET21a+ là vector biểu hiện . Vector pET21a+ là vector biểu hiện mạnh có kích thước 5443bp, mang một trình tự T7-tag ở đầu N’ tại vị trí 207 đến 239, và trình tự His-tag ở đầu C’ tại vị trí 140 đến 157.
Vector pET21a+ chứa promotor T7 có nhiệm vụ khởi đầu q trình phiên mã. Trình tự T7-tag và His-tag có chức năng cung cấp điểm khởi đầu dịch mã và kết thúc quá trình dịch mã cũng như tinh sạch protein bằng liên kết ái lực.
Vector có gen kháng ampicilline thuận lợi cho q trình chọn lọc dịng vi khuẩn sau này. Một đặc điểm khác của vector biểu hiện ở mức độ dịch mã so với các vector biểu hiện ở mức độ phiên mã là phải có trình tự rbs (ribosome binding site-vị trí liên kết ribosome) được thiết kế ở giữa vị trí của promotor và đoạn gen được chèn vào. Như vậy việc biểu hiện protein tái tổ hợp có thể được thực hiện bằng cách xen đoạn ADN đích vào vùng đa tách dòng (Multiple Cloning Site-MCS) của vector biểu hiện. Để tạo nguồn vector biểu hiện, tiến hành nuôi lỏng chủng E.coli DH5α đã được biến nạp pET21a+ trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin 100mg/l qua đêm ở máy lắc 370C, 220 vịng/phút. Sau đó tách chiết
plasmid pET21a+.
-Xử lý bằng enzym giới hạn trên pET21a+
.Tiến hành cắt mở vòng plasmid pET21a+ đã tách từ E.coli DH5α bằng hai enzym BamHI và HindIII trong 3 giờ ở 370C để tạo vết cắt giống với đoạn gen ESAT6- CFP10 sẽ cài vào. Kết quả mở vịng vector pET21a+ được thể hiện trên hình 3.5.
-Xử lý bằng enzym giới hạn trên pGEMT-ESAT6-CFP10.
Khi thiết kế mồi, chúng tôi đã thiết kế thêm trình tự nhận biết của hai enzym cắt
sử dụng chính hai enzym này để tạo đầu cắt so le phù hợp cho đoạn gen thu được sau khi tinh sạch sản phẩm của phản ứng.
Sản phẩm PCR sau khi được xử lý bằng hai enzym được tinh sạch theo quy trình của bộ kit tinh sạch ADN (QIAGEN).
Do trong sản phẩm cắt vẫn có những tạp chất tham gia phản ứng cịn dư thừa; vì vậy để tăng hiệu quả kết nối gen vào vector cần thiết phải tinh sạch sản phẩm cắt. Tinh sạch ADN là phương pháp thu đoạn ADN tinh khiết dựa trên nguyên lý sử dụng các hạt sepharose để giữ các phân tử ADN đã được gắn với các hạt ion lúc mix sản phẩm cắt trong đệm gắn. Do đó, khi chuyển hỗn hợp ADN, enzym, muối chứa trong các đệm…lên cột phân tách, chỉ có ADN được gắn lên mạng lưới, cịn các thành phần khác như protein, muối sẽ bị rửa trơi qua cột. Sau đó, để tách ADN ra khỏi cột người ta sử dụng đệm tách.