(M: Thang ADN 100bp; 1: Chứng âm; 2-12: Khuẩn lạc chứa pET21a+/CFP10- ESAT6).
Kết quả trên hình 3.7 cho thấy ở tất cả các giếng kiểm tra (trừ giếng đối chứng âm) đều xuất hiện một băng duy nhất trên đường chạy với kích thước khoảng 645bp tương ứng với kích thước của gen đích.
Như vậy chúng tôi đã biến nạp thành công plasmid tái tổ hợp pET21a+/ESAT6-CFP10 vào chủng E.coli BL21(DE3). Từ kết quả này, chúng tôi quyết định chọn ngẫu nhiên 2 dòng khuẩn lạc chứa pET21+/CFP10-ESAT6 để kiểm tra khả năng biểu hiện của gen ESAT6-CFP10 tái tổ hợp.
3.2.2. Kiểm tra sự biểu hiện gen CFP10/ESAT6
Gen ESAT6/CFP10 trong vector biểu hiện hoạt động dưới sự biểu hiện của T7 lac promoter và được kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG (isopropyl-β-D- thiogalactoside) có trong mơi trường. Do đó, để nghiên cứu sự biểu hiện của protein tái tổ hợp, vi khuẩn sau khi biến nạp thành công được nuôi cấy trong mơi trường LB lỏng có kháng sinh ampicilline và chất cảm ứng IPTG.
Trước khi thực hiện cảm ứng biểu hiện bằng IPTG, các tế bào vi khuẩn E.coli BL21(DE3) chứa plasmid tái tổ hợp cần phải được hoạt hóa bằng cách ni lắc ở nhiệt độ 370C trong môi trường LB chứa kháng sinh ampicilline 100mg/l cho đến khi các tế bào bước vào pha sinh trưởng (OD600 nằm trong khoảng 0,4 đến 0,6). Sau 3 giờ cảm ứng IPTG 1mM ở nhiệt độ 370C, tiến hành ly tâm 8000 vòng trong 5 phút để thu sinh khối tế bào. Đối với mẫu đối chứng âm, các tế bào E.coli BL21 (DE3) chứa plasmid tái tổ hợp và tế bào E.coli BL21 (DE3) không chứa plasmid tái tổ hợp cũng được hoạt hóa trên mơi trường chứa kháng sinh ampicilline 100mg/l ở nhiệt độ 370C cho đến mật độ tế bào thích hợp. Sau đó các tế bào này cũng được biểu hiện ở nhiệt độ 370C nhưng không bổ sung IPTG (với đối chứng (-) có vector biểu hiện), và bổ sung 1mM IPTG (với đối chứng (-) khơng có vector biểu hiện) trước khi thu sinh khối tế bào như trên. Sau đó, chúng tơi tiến hành pha lỗng sinh khối tế bào bằng dung dịch đệm PBS 1X và vỡ tế bào bằng cách siêu âm, thu protein tổng số và chạy điện di protein trên gel polyacrylamid để kiểm tra sự biểu hiện.
Kết quả kiểm tra protein tổng số của các dòng tế bào mang plasmid pET21a+/ESAT6-CFP10 tái tổ hợp được trình bày ở hình 3.8.
M +IPTG - IPTG