3.2. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN ESAT6/CFP10
3.2.1. Biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/ESAT6-CFP10 vào E.coli chủng BL21(DE3)
E.coli BL21(DE3) là chủng vi khuẩn biểu hiện gen thường được sử dụng khi biểu hiện
một protein lạ và là vật chủ phù hợp cho biểu hiện protein khi dùng vector biểu hiện có chứa promoter T7 hoặc lac promoter T7 như vector pET21a+. Hơn nữa chủng vi khuẩn E.coli BL21(DE3) đã được biến đổi để tăng cường khả năng biểu
Atg gct agc atg act ggt gga cag caa atg ggt cgc gga tcc atg gca gag atg aag acc M A S M T G G Q Q M G R G S M A E M K T Gat gcc gct acc ctc gcg cag gag gca ggt aat ttc gag cgg atc tcc ggc gac ctg aaa D A A T L A Q E A G N F E R I S G D L K Acc cag atc gac cag gtg gag tcg acg gca ggt tcg ttg cag ggc cag tgg cgc ggc gcg
T Q I D Q V E S T A G S L Q G Q W R G A
gcg ggg acg gcc gcc cag gcc gcg gtg gtg cgc ttc caa gaa gca gcc aat aag cag aag
A G T A A Q A A V V R F Q E A A N K Q K
Cag gaa ctc gac gag atc tcg acg aat att cgt cag gcc ggc gtc caa tac tcg agg gcc
Q E L D E I S T N I R Q A G V Q Y S R A
Gac gag gag cag cag cag gcg ctg tcc tcg caa atg ggc ttc ggt ggc ggt gga agc ggc D E E Q Q Q A L S S Q M G F G G G G S G Ggt ggc gga agc ggc ggt ggc ggc agc atg aca gag cag cag tgg aat ttc gcg ggt atc
G G G S G G G G S M T E Q Q W N F A G I
Gag gcc gcg gca agc gca atc cag gga aat gtc acg tcc att cat tcc ctc ctt gac gag E A A A S A I Q G N V T S I H S L L D E Ggg aag cag tcc ctg acc aag ctc gca gcg gcc tgg ggc ggt agc ggt tcg gag gcg tac G K Q S L T K L A A A W G G S G S E A Y Cag ggt gtc cag caa aaa tgg gac gcc acg gct acc gag ctg aac aac gcg ctg cag aac Q G V Q Q K W D A T A T E L N N A L Q N Ctg gcg cgg acg atc agc gaa gcc ggt cag gca atg gct tcg acc gaa ggc aac gtc act L A R T I S E A G Q A M A S T E G N V T Ggg atg gtc gcg aag ctt gcg gcc gca ctc gag cac cac cac cac cac cac tga G M V A K L A A A L E H H H H H H Stop
protein ngoại lai. Bởi vậy, đây là chủng phù hợp với đối tượng và mục đích nghiên cứu của đề tài.
Sau khi chọn dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen ESAT6-CFP10, chúng tôi tiến hành biến nạp sản phẩm tái tổ hợp thu được từ dịng đó vào tế bào khả biến E.coli chủng BL21(DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt. Dịch khuẩn được nuôi cấy trải trên môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh ampicilline 100mg/l. Tế bào E.coli BL21(DE3) khơng có khả năng kháng kháng sinh ampicilline nên sau khi biến nạp và nuôi cấy trải trên mơi trường LB đặc có bổ sung ampicilline 100mg/l sẽ có các trường hợp sau xảy ra:
+ Các tế bào không chứa vector tái tổ hợp sẽ không mọc được trên mơi trường có chứa kháng sinh ampicilline.
+ Các tế bào có chứa vector tái tổ hợp pET21a+/CFP10-ESAT6 mang gen mã hóa cho CFP10-ESAT6 và có gen kháng kháng sinh nên mọc được trên môi trường chọn lọc. Để chắc chắn hơn nữa về sự có mặt của plasmid tái tổ hợp trong các dòng khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy, chúng tôi chọn ngẫu nhiên một số dòng khuẩn lạc và tiến hành PCR trực tiếp từ khuẩn lạc này với cặp mồi đặc hiệu P1; P4.
Sản phẩm colony-PCR được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra và kết quả được thể hiện trên hình 3.7.
645bp