CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
Máy móc thiết bị phục vụ thí nghiệm:
Bảng2.1. Thiết bị thí nghiệm
STT Tên thiết bị Xuất xứ
1 Tủ sấy khử trùng New Zealad
2 Nồi hấp áp lực Nhật Bản
3 Kính hiển vi điện tử Nhật Bản
4 Buồng cấy vô trùng Singapo
5 Tủ ấm New Zealad
6 Máy Vortex Mỹ
7 Cân phân tích Thụy Sỹ
8 Cân điện tử Thụy Sỹ
9 Máy đo pH Nhật Bản
Các dụng cụ thí nghiệm:
- Dụng cụ: Pipetman, pipet thủy tinh, ống nghiệm nút xoáy, đĩa petri, que cấy, que trang, bình tam giác, lọ thủy tinh, đũa thủy tinh, cốc đong, bình định mức…
Ngồi ra, cịn có các thiết bị dụng cụ khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như: máy cơ quay, lị vi sóng, dao, thớt, rổ giá, các bình lên men thể tích 500ml, xoong nồi, bếp ga, bếp điện...
2.3. Phƣơng pháp thí nghiệm
2.3.1. Phương pháp vi sinh
2.3.1.1. Phương pháp phân lậpvà định danh sơ bộ vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic được phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống trên mơi trường MRS agar có bổ sung CaCO3. Cân 25g mẫu vào bình tam giác chứa 225ml nước cất vô trùng, hỗn hợp được lắc 100 v/p ở 30°C trong 1 giờ trên máy lắc. Tiếp tục pha loãng mẫu 102, 103, 104, 105, 106 lần trong ống nghiệm. Hút 100 µl mẫu pha lỗng vào đĩa petri chứa môi trường phân lập rồi trang đều mẫu trên bề mặt đĩa thạch. Mẫu sau khi trang cấy được giữ ở tủ ấm 30°C trong 5 ngày. Dựa vào hình thái khuẩn lạc, khả năng tạo axit trên môi trường MRS, các khuẩn lạc vi khuẩn được cấy ria làm sạch và bảo quản. Tiến hành định danh sơ bộ vi khuẩn lactic: nhuộm gram, thử nghiệm catalase.
2.3.1.2. Phương pháp sơ tuyển chủng vi khuẩn lactic lên men gừng tươi
Hoạt hóa các chủng vi khuẩn đã phân lập trên môi trường MRS (lỏng) ở 30°C trong 24 giờ. Hút 1ml dịch hoạt hóa (mật độ 108 tế bào/ml) vào 10 ml mơi trường MRS có tỉ lệ dịch chiết gừng 10-100%. Lên men các chủng ở 30°C trong 3 ngày. Xác định mật độ tế bào của các chủng sau thời gian lên men.
2.3.1.3. Phương pháp định danh chủng vi khuẩn lactic.
Các chủng được tuyển chọn được xác định đặc điểm sinh học phân tử dựa trên trình tự gen 16S rRNA.Trình tự của 16S rRNA được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động 3100 Avant Genetic Analyzer sử dụng POP-6 polymer. Sắc đồ trình tự được kiểm tra và chỉnh sửa trên phần mềm Chromas lite 2.1. Trình tự của 2 mồi 780F và 920R được kết nối trên phần mềm Clone Manager. Mức độ tương đồng về trình tự gen mã hóa riboxơm 16S của chủng nghiên cứu so với các chủng đã công bố trên ngân hàng gen được so sánh sử dụng công cụ tra cứu BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Mức độ tương đồng cao nhất về trình tự đoạn 16S rDNA của chủng nghiên cứu so với các chủng chuẩn đã công bố được tra cứu sử dụng cơ sở dữ liệu Eztaxon-e (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/).
2.3.2. Phương pháp phân tích hóa lý
2.3.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng tinh bột
Nguyên tắc: Thủy phân tinh bột trong nguyên liệu thành đường với HCl 2% đun sôi
trong 2 giờ. Dung dịch sau thủy phân được trung hòa bằng NaOH 10% và Metyl da cam 1%. Hàm lượng đường sau khi thuỷ phân được xác định bằng phương pháp Graxianop. Lượng đường hình thành từ quá trình thuỷ phân tinh bột bằng lượng dung dịch sau khi đem thuỷ phân sinh ra trừ đi lượng đường khử trong dung dịch trước thuỷ phân. Được kết quả đem nhân với hệ số chuyển đổi từ đường khử (glucose) thành tinh bột là 0,9 ta sẽ có được hàm lượng tinh bột trong mẫu nguyên liệu ban đầu.
Hóa chất: HCl 2%; NaOH 10%: Metyl da cam 1%. Tiến hành:
Bước 1: Xử lý nguyên liệu
Cân 60g gừng tươi, mài vụn bằng dụng cụ mài. Sau đó cho vào 3 bình tam giác 250ml với 20g/ bình. Cho HCl 2% vào mỗi bình (ngập mẫu).
Đặt bình lên bếp đun cách thủy đến 2h, lấy ra để nguội. Cho 4-5 giọt Metyl da cam. Sau đó trung hịa bằng NaOH 10% đến khi dung dịch đổi màu (pH= 7).
Lọc lấy dịch vào 3 bình định mức 250ml→ thêm nước cất đến vạch định mức. Trút dung dịch sang bình tam giác, mang đi thí nghiệm bằng phương pháp Granxinop (dùng dịch mẫu thu được làm chất chuẩn độ).
Bước 2: Xác định hàm lượng đường bằng phương pháp Graxianop
Hút 20ml dd K3Fe(CN)6 + 5ml dd KOH 2,5N vào bình tam giác miệng rộng, đun sơi trên bếp, đến khi sôi cho vài giọt xanh melylen, dung dịch chuyển màu xanh lá thì dùng dịch mẫu đã pha lỗng để chuẩn độ đến khi dung dịch chuyển màu vàng nhạt thì dừng lại. Ghi lại số ml mẫu đã tiêu hao.
Cơng thức tính hàm lượng tinh bột (%): TB (%) =𝑎×250×100×0,9
𝑏×𝑚
Trong đó: a - số gam glucose tương ứng với 20ml ferixyanua kali (0,025g)
b - số ml mẫu tiêu hao khi định phân (thể tích mẫu đem đi phân tích) m - số gam mẫu thí nghiệm (20g)
0,9 - Hệ số chuyển đổi glucose thành tinh bột
2.3.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng
Nguyên tắc: : Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường với thuốc thử axit 3,5- Dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường. Đo màu trên máy phổ quang học ở bước sóng 490nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường tổng.
Hóa chất:
Dung dịch glucose chuẩn: Pha dung dịch glucose chuẩn 10g/l (Cân 0,2g glucose chuẩn, sấy bằng cân hút ẩm, định mức đến 20ml). Sau đó pha lỗng 10 lần dung dịch trên (hút 1ml glucose 10g/l + 9ml nước cất), được dung dịch glucose chuẩn 1g/l. Lập dải nồng độ chuẩn (mg/l): 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80
H2SO4 đặc (98%) Phenol 5%
Tiến hành:
Bước 1: Pha loãng mẫu
Pha loãng mẫu với dải d= 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 Bước 2:
Hút 0,5ml mỗi mẫu đã pha loãng và mẫu chuẩn vào các ống nghiệm tương ứng. Hút 0,5ml Phenol 5% vào các ống nghiệm trên, thêm vào 2,5ml H2SO4 đặc, lắc đều, để nguội.
Mang các ống nghiệm đo chỉ số OD ở bước sóng 490nm trên máy quang phổ khả biến. Ghi lại mỗi kết quả hiển thị trên màn hình máy đo OD.
2.3.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng nhựa dầu gừng [6]
Nguyên tắc: Trích ly nhựa dầu gừng bằng cồn trong 24 giờ. dịch trích ly được lọc
kỹ trên giấy lọc và mang đi cô quay bằng máy cô chân không, cồn trong dung dịch bay hơi ở 50-55oC, sau khi cồn bay hơi hết ta sẽ thu được lượng nhựa dầu gừng cịn lại trong bình quay.
Hóa chất: Dung dịch cồn Tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Nguyên liệu gừng (tươi, non), cân 1kg/mẫu. Thái lát mỏng, phơi khô, sấy bằng tủ sấy đến khi miếng gừng khô (hàm lượng nước khoảng 5-7%).
Bước 2: Trích ly nguyên liệu với cồn
Gừng sau khi sấy khô được xay nhỏ bẳng máy xay đa năng, chia vào các bình tam giác thành 2 loại gừng trâu và gừng gié. Đổ cồn vào mỗi bình cho ngập gừng, sử dụng máy lắc để lắc trong khoảng 24h, với 2 lần trích ly (thay cồn mới sau khoảng 12h sao cho tổng lượng cồn sử dụng cho 1kg gừng khoảng 2l), sau đó vắt lấy dịch trích ly và lọc trên giấy lọc.
Bước 3: Lấy dịch trong thu được mang đi cô chân không tới trọng lượng không đổi. Lượng nhựa dầu gừng thu được đem đi cân và so sánh hàm lượng nhựa dầu gừng giữa gừng trâu và gừng gié.
2.3.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng axit tổng số (theo axit lactic)
Nguyên tắc:Hàmlượng axit lacticcó trong mẫu được trung hòa bằng dung dịch
NaOH 0,1 N. Từ thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu hao trong khi chuẩn độ sẽ tính được hàm lượng axit.
Hóa chất: NaOH 0,1 N
Phenolphtalein 1% Nước cất
Tiến hành: Lấy 10ml mẫu cho vào bình định mức 250ml, thêm nước cất tới vạch
bình, lắc đều, sau đó lấy 20ml dung dịch đã pha cho vào bình tam giác 100ml, cho vài giọt phenolphtalein 1%. Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch mẫu từ khơng mà chuyển sang màu phớt hồng thì dừng lại. Ghi lại số ml NaOH đã tiêu hao.
Hàm lượng axit được tính theo cơng thức: Axit =𝑁×𝑑×0,009×1000𝑉
Trong đó:
N: Thể tích NaOH 0,1N tiêu hao d: Hệ số pha lỗng mẫu
V: Thể tích mẫu chuẩn độ
2.3.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với
thuốc thử axit 3,5-Dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Đo màu trên máy phổ quang học ở bước sóng 570nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử.
Hóa chất:
Dung dịch glucose chuẩn nồng độ 10g/l (cân 0,2g glucose của hãng Merck đã sấy bằng cân hàm ẩm hòa tan bằng nước cất và định mức tới 20ml) → Pha loãng bằng nước cất thành các dung dịch có dải nồng độ từ 0- 1,2 g/l.
Dung dịch DNS: Hòa tan (0,1g 3,5 axit Dinitrosacylic (DNS) + 30g Natri Kali tartrate) trong 20ml NaOH 2M → định mức tới 100ml.
Tiến hành:
Bước 1: Dựng dải nồng độ glucose chuẩn
Bảng 2.2.Dựng đƣờng chuẩn glucose
Nồng độ glucose chuẩn (g/l) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Số ml dd glucose 10g/l 0 0,06 0,12 0,18 0,24 0,3 0,36
Số ml nƣớc cất 3 2,94 2,88 2,82 2,76 2,7 2,64
OD(570nm) 0 0,167 0,328 0,471 0,603 0,715 0,83 Bước 2: Pha loãng mẫu nếu cần thiết
Bước 3: Hút 3ml mẫu + 1,5 ml DNS trộn đều, đậy nắp, đun sơi cách thủy trong 10 phút (tính từ khi nước sơi). Lấy ra để nguội đến nhiệt độ phịng. Mang đo OD ở bước sóng 570nm. Ghi lại kết quả thu được.
2.3.3. Phương pháp công nghệ
2.3.3.1. Xử lý nguyên liệu
Gừng nguyên liệu được rửa sạch, phơi khơ 2 ngày trong bóng râm. Gọt vỏ, ngâm 24h với nước muối 3%. Thái lát mỏng, khoảng 1mm, sau đó trần qua nước sơi 10 phút→ vớt ra ngâm với nước đá để miếng gừng được ngon, giòn
Xếp miếng gừng vào mỗi bình dung tích 500ml ( các bình đã được khử trùng) sao cho lượng nguyên liệu bằng nhau ở mỗi bình.
2.3.3.2. Lên men
Cho dịch mơi trường vào mỗi bình lên men với tỉ lệ cái: nước= 1:2 Đậy chặt nắp, chuyển vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp / 5 ngày.
2.3.3.3. Phối chế sản phẩm
Phối chế sản phẩm là bước cuối cùng trong quy trình sản xuất gừng muối chua. Sản phẩm sau lên men sẽ được phối màu từ các loại rau củ quả như rau tía tơ, củ rền...tạo nên sự đa dạng cho sản phẩm.
Phối chế đường và muối theo các tỉ lệ khác nhau để được các sản phẩm cho chất lượng tốt. Các sản phẩm sau khi phối chế được đánh giá cho điểm thị hiếu về các tính chất màu sắc, vị chua, vị ngọt, vị mặn để tìm ra tỉ lệ được ưa thích.
Thực hiện phối chế:
Chuẩn bị
Đường kính trắng, dịch lên men (lấy dịch lên men ở các bình đã lên men → Lọc lấy dịch trong), nước màu: đun sơi trong 10 phút lá tía tơ và dịch chua lên men với tỉ lệ cái: nước = 1:6, lát gừng đã lên men: rửa sạch với nước muối 3% sau đó cho vào nước đã đun sơi và đun trong 3 phút rồi vớt ra ngâm với nước đá, bình chứa (bình lên men): 50g gừng+ 100ml dịch/bình.
Tiến hành:
Dịch lên men sẽ phối chế với đường và muối theo tỉ lệ sau:
Bảng 2.3. Tỉ lệ phối chế sản phẩm sau lên men
mẫu dịch lên men: nƣớc
cất Đƣờng (g/l) Muối (g/l)
Mẫu 1 3:2 212 17
Mẫu 2 1:1 180,5 16,5
Mẫu 3 100% dịch lên men 400 20
Sau khi đã pha xong và dán nhãn các bình , cân 50g gừng đã chuẩn bị vào mỗi bình, sau đó mang đi hấp 80 độ C/ 10 phút.
Đánh giá cảm quan : sử dụng phương pháp cho điểm thị hiếu theo thang điểm từ
1đến 9 để lựa chọn tỉ lệ phối chế màu, đường và muối được ưa thích.
2.3.4. Phương pháp đánh giá cảm quan
Sau mỗi thí nghiệm, với mục đích lựa chọn được tỉ lệ và điểu kiện lên men thích hợp nhất, chúng tôi đã tiến hành đánh giá cảm quan sản phẩm.
Phương pháp cho điểm theo tiêu chuẩn và phương pháp đánh giá thị hiếu (phép thử cặp đôi thị hiếu) [7]. Hai mươi người được thử là các cán bộ nghiên cứu Viện Công nghiệp thực phẩm, trong độ tuổi: 22-52 tuổi. Người thử được yêu cầu cho biết mức độ ưa thích của mình (theo thang điểm 1-9) về các sản phẩm gừng tươi lên men như sau:
1: cực kỳ khơng thích 2: rất khơng thích
4: hơi khơng thích 5: khơng thích cũng khơng ghét 6: hơi thích 7: thích 8: rất thích 9: cự kỳ thích
Từ giá trị điểm trung bình của từng sản phẩm, xác định giá trị t, và so sánh với giá trị tiêu chuẩn (ttc) ở mức ý nghĩa α=5%. Mức độ ưa thích khác nhau có ý nghĩa khi t>ttc.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tích chất lƣợng nguyên liệu gừng 3.1. Phân tích chất lƣợng nguyên liệu gừng
3.1.1. Hàm lượng nhựa dầu gừng
Nhựa dầu gừng tạo nên vị cay trong củ gừng nhưng bên cạnh đó nó cũng tạo hương vị đặc trưng của gừng mà không thể lẫn với một loại củ quả nào được , nếu hàm lượng nhựa dầu nhiều sẽ khiến sản phẩm lên men có nhiều vị cay, tuy nhiên nếu hàm lượng quá ít sản phẩm sẽ có ít mùi vị đặc trưng của ngun liệu. Chúng tơi đã tiến hành các thí nghiệm phân tích hàm lượng nhựa dầu gừng từ các loại gừng trâu và gừng gié được thu mua tại chợ Dương Liễu, Hoài Đức, Hà Nội để so sánh và lựa chọn nguyên liệu phù hợp.
Gừng tươi sau khi vận chuyển về được đo hàm lượng nước cho kết quả: Gừng Trâu 92,5% và gừng dé 91,6%.
Sau đó rửa sạch và để ráo nước, cân lấy mỗi loại 1kg gừng trâu và gừng gié thái lát, phơi khô và sấy đến khi hàm ẩm đạt 5- 7 % sẽ mang đi làm thí nghiệm phân tích nhựa dầu gừng. Kết thúc thí nghiệm, kết quả thu được như sau:
Bảng 3.1. Hàm lƣợng nhựa dầu gừng nguyên liệu
Loại nguyên
liệu Hàm lượng nhựa
dầu gừng trong 1kg gừng tươi (g)
Cảm quan nhựa dầu gừng thu được
Gừng Trâu 10,2 Màu sắc: nâu đậm, hơi ánh vàng.
Mùi vị: Cay nồng đặc trưng, hương thơm dễ chịu
Gừng Gié 19,4 Màu sắc: Nâu đậm
Mùi vị: Cay nồng đặc trưng nhưng có phần hơi nhiều nên mùi hương hơi sốc.
Từ kết quả thu được trong bảng trên, có thể thấy ở Gừng gié hàm lượng nhựa dầu gừng là rất cao (> 9,2 g) so với Gừng trâu, vì hàm lượng cao như vậy nên dẫn đến phần cảm quan có thể dễ nhận thấy sự khác biệt giữa 2 loại nguyên liệu, và Gừng trâu phù hợp để làm nguyên liệu lên men hơn.
3.1.2. Hàm lượng tinh bột
Để xác định hàm lượng tinh bột của loại gừng trâu sử dụng làm nguyên liệu lên men chúng tơi đã tiến hành thí nghiệm với 3 lần lặp lại: lần 1 = 35,16 (g/kg); lần 2 = 35,60 (g/kg); lần 3 = 35,49g/kg.
Sau khi xử lí số liệu bằng phần mềm SPSS với phép thử T- Testvới hàm lượng tinh bột trong gừng là 34,5 (g/kg)mức ý nghĩa 5%.
3.1.3.Hàm lượng đường tổng
Thí nghiệm được thực hiện lặp 3 lần, với kết quả trung bình thể hiện như sau:
Bảng 3.2.Hàm lƣợng đƣờng tổng trong gừngnguyên liệu
Độ pha lỗng mẫu (lần) Trung bình HL đƣờng tổng(g/kg)*
20 3,551abc 30 3,776abc 40 3,712abc 50 2,580de 100 1,982de Tổng trung bình HL đường tổng (g/kg) 3,121
* Trung bình 3 lần thí nghiệm, các giá trị trung bình có cùng chữ cái theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức α = 0,05.
Từ bảng trên ta có hàm lượng đường tổng trong củ gừng nguyên liệu khoảng 3,121 g/kg.
Tổng hợp kết quả phân tích nguyên liệu gừng
Bảng 3.3. Kết quả phân tích thành phần nguyên liệu gừng tƣơi
Chỉ tiêu Kết quả
Hàm ẩm (%) 92,5
Nhựa dầu tổng (g/kg) 10,2
Tinh bột (g/kg) 34,5
Đường tổng (g/kg) 3,121
Từ các kết quả phân tích chất lượng nguyên liệu gừng, có thể kết luận củ gừng trâu phù hợp để lên men gừng muối chua.
3.2. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic thích hợp cho lên men gừng
3.2.1. Phân lập chủng vi khuẩn lactic
28 chủng vi khuẩn lactic đã được phân lập từ 6 loại sản phẩm lên men: kim