* Ưu điểm và nhược điểm của công nghệ SBR:
+ Ưu điểm:
– Không cần bể lắng và tuần hoàn bùn.
– Trong pha làm đầy bể SBR đóng vai trị như bể cân bằng vì vậy bể SBR có thể chịu dựng được tải trọng cao và sốc tải.
– Có thể hạn chế được sự phát triển của vi khuẩn sợi thông qua việc điều chỉnh tỉ số F/M và thời gian thổi khí trong q trình làm đầy.
– Ít tốn diện tích đất xây dựng do các quá trình cân bằng cơ chất, xử lý sinh học và lắng được thực hiện trong cùng một bể.
– Dễ dàng bảo trì, bảo dưỡng thiết bị (các thiết bị ít) mà khơng cần phải tháo nước cạn bể. Chỉ tháo nước khi bảo trì các thiết bị như: cánh khuấy, motor, máy thổi khí, hệ thống thổi khí.
– Hệ thống có thể điều khiển hồn tồn tự động
– TSS đầu ra thấp, hiệu quả khử photpho, nitrat hóa và khử nitrat hóa cao. – Ít tốn diện tích do khơng có bể lắng 2 và q trình tuần hồn bùn.
+ Nhược điểm:
– Nếu như quá trình lắng bùn xảy ra sự cố thì sẽ dẫn đến bùn bị trơi theo ống đầu ra.
– Khi xả tốc độ dòng chảy rất lớn sẽ làm ảnh hưởng đến các hệ thống xử lý phía sau.
– Có thể xảy ra quá trình khử nitrat trong pha lắng nếu như thời gian lưu bùn dài. Điều này sẽ dẫn đến hiện tượng bùn nổi do bị khí nitơ đẩy lên. Hiện tượng này càng nghiêm trọng vào những ngày nhiệt độ cao.
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Nước thải làng nghề sản xuất bún Phú Đô.
- Các chủng vi sinh vật tham gia vào quá trình làm sạch nước thải chế biến tinh bột được phân lập từ rãnh nước thải ở các làng nghề chế biến tinh bột.
2.1.2. Dụng cụ và hoá chất
2.1.2.1. Dụng cụ
- Nồi khử trùng ướt (Tawai) - Tủ sấy khô (Sellab -Mỹ) - Tủ ấm ổn nhiệt (Sellab - Mỹ) - Tủ lạnh (Hàn Quốc)
- Máy đo pH (Nhật Bản)
- Máy lắc ổn nhiệt (Sellab-Mỹ) - Tủ cấy vô trùng (Singapo)
- Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật) - Máy đo mật độ quang (Shimazu)
- Cân phân tích (Nhật) - Lị vi sóng
- Ống đong: 100ml, 500ml - Cốc đong: 200ml, 1lit, 2 lit
- Các dụng cụ vi sinh khác: ống nghiệm, hộp petri, que cấy, que trang, lam kính, đèn cồn….
2.1.2.2. Hóa chất
- Thạch (Agar) (Merck- Đức) - Cao thịt (Merck-Đức) - Pepton (Merck-Đức ) - Cao nấm men (Merck-Đức) - Bột xenluloza (Nhật)
- Các hố chất vơ cơ khác: NaCl, KH2PO4, MgSO4.7H2O, KNO3….
2.1.3. Môi trường
Môi trường dinh dưỡng sử dụng để phân lập, nuôi cấy, và thử các hoạt tính hố lý của các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu: MPA, tinh bột sống, tinh bột chín,…
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu nước thải
Mẫu được lấy ở các mương nước thải tại các làng nghề chế biến tinh bột. Các mẫu được phân tích ngay sau khi đưa về phịng thí nghiệm, thời gian lưu mẫu không quá 48 giờ.
2.2.2. Phương pháp xác định sinh khối tế bào theo mật độ quang
Tốc độ tích lũy sinh khối của vi sinh vật được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang (OD560nm) của dịch nuôi cấy trên máy quang phổ kế. Sinh khối của VK được xác định bằng kết quả đo OD của dịch nuôi cấy so với môi trường nuôi cấy ban đầu.
2.2.3. Phương pháp phân lập vi sinh vật
Bƣớc 1: Chuẩn bị môi trường và dụng cụ
+ Môi trường: Môi trường tinh bột sống và mơi trường tinh bột chín. + Bình pha lỗng: Bình tam giác 250 ml, mỗi bình chứa 90 ml nước máy. + Ống pha loãng: Mỗi ống chứa 9 ml nước muối sinh lý.
Mơi trường, bình và ống pha lỗng sau đó được đem khử sạch trong nồi khử trùng thời gian 15 phút, nhiệt độ 121oC và áp suất 1 atm. Môi trường sau khi đã vô trùng được đem đổ vào các đĩa petri vô trùng với một lượng phù hợp.
Bƣớc 2: Xác định thành phần và số lượng vi sinh vật theo phương pháp pha
loãng tới hạn.
+ Lấy 1ml nước thải cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước đã thanh trùng, lắc cho mẫu tan đều.
+ Sử dụng pipet hút 1ml mẫu đã pha loãng ở nồng độ 10-1 vào ống nghiệm chứa 9ml nước thanh trùng, ta được độ pha loãng 10-2. Tiếp tục cho tới khi dịch mẫu được pha loãng tới nồng độ 10-8.
+ Dùng pipet vơ trùng lấy 100µl dịch pha loãng ở các nồng độ 10-5
, 10-6, 10-7 lên trên bề mặt môi trường thạch đặc hiệu cho từng loại vi sinh vật trong đĩa petri vô trùng. Dùng que gạt thủy tinh vơ trùng dàn đều giọt dịch đó trên bề mặt thạch. Nuôi cấy ở 300C trong tủ ấm. Sau 1-2 ngày lấy ra quan sát và đếm các khuẩn lạc hình thành [6].
2.2.4. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải tinh bột
Phân lập vi sinh vật từ mẫu bùn, nước thải từ làng bún Phú Đơ, Dương Liễu theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.3. Sau 48h, quan sát các khuẩn lạc có hình thái khác nhau, mã hóa và cấy chuyển sang ống thạch nghiêng. Sau đó sử dụng que cấy vô trùng cấy chuyển theo phương pháp cấy chấm điểm mỗi khuẩn lạc vào 1 đĩa tinh bột sống (TBS) và 2 đĩa tinh bột chín (TBC). Ni ở 30oC trong 48h.
Sau 48h, sử dụng dung dịch lugol để kiểm tra hoạt tính phân giải của các chủng đã phân lập được trên môi trường tinh bột sống và tinh bột chín. Tuyển chọn những chủng vi sinh vật có vịng phân giải tinh bột lớn.
Các giống vi sinh vật thuần chủng trong các ống nghiệm được giữ ở nhiệt độ 40C- 60C trong tủ lạnh. Mỗi tháng cấy truyền định kỳ sang môi trường mới [6,7,8]
2.2.5. Phương pháp tinh sạch, giữ giống và hoạt hóa vi sinh vật
- Tinh sạch: Sau khi tuyển chọn được vi sinh vật, ta tiến hành tinh sạch trên môi trường MPA. Sử dụng que cấy đầu tròn lấy một lượng nhỏ sinh khối vi sinh vật, cấy ziczac liên tiếp lên 3 đĩa MPA. Đem nuôi trong tủ ấm 30oC trong 48h. Sau 48h, bỏ đĩa thạch ra và quan sát, nếu thấy xuất hiện những khuẩn lạc riêng rẽ, tách rời nhau và có hình dạng giống nhau thì chủng vi sinh vật đã sạch, khơng bị nhiễm chủng khác và tiếp tục tiến hành giữ giống [6]
- Giữ giống: Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ và cấy ziczac vào ống thạch nghiêng có chứa mơi trường MPA. Sau đó đem ni ở tủ ấm trong 48h. Sau 48h mang ra và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C, trong thời
gian tốt nhất là 1 tháng. Sau 1 tháng phải cấy truyển định kỳ để đảm bảo dinh dưỡng cho vi sinh vật. Trước khi sử dụng chủng thuần cần được hoạt hóa [7].
- Hoạt hóa: Hoạt hóa theo phương pháp cấy chấm điểm: Lấy một lượng nhỏ vi
sinh vật từ trong ống thạch giống và cấy chấm điểm vào mơi trường MPA hoặc mơi trường tinh bột chín. Ni trong tủ ấm trong 24h.
Phương pháp hoạt hóa trong mơi trường dịch thể: Lấy một lượng nhỏ vi sinh vật cho vào bình tam giác có chứa mơi trường MPA dịch thể. Đem nuôi trong tủ lắc trong 24h, nhiệt độ 30oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút [8].
2.2.6. Phương pháp đánh giá khả năng sinh amylase của các chủng vi
sinh vật tuyển chọn
Để đánh giá khả năng sinh amylase của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn ta tiến hành nuôi các chủng vi sinh vật trong môi trường MPB. Amylase sẽ được vi sinh vật tiết ra môi trường trong quá trình trao đổi chất [6]
Ta tiến hành theo các bước sau:
Bƣớc 1: Chuẩn bị môi trường và hoạt hóa giống.
Mơi trường ni là mơi trường MPB. Hoạt hóa giống trong mơi trường MPB
Bƣớc 2: Cấy giống
Dùng pipet hút 1ml dịch sau hoạt hóa cho vào các bình chứa mơi trường MPB, tiếp tục đem nuôi ở tủ lắc trong 24h, nhiệt độ 30oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút.
Bƣớc 3: Chuẩn bị môi trường thạch đục lỗ
Môi trường dinh dưỡng được đổ vào các đĩa thạch (khoảng 30ml/đĩa), để nguội. Sau đó tiến hành đục lỗ trên đĩa thạch.
Bƣớc 4: Ly tâm
Ly tâm nhằm mục đích tách riêng sinh khối vi sinh vật, thu lấy dịch thể để xác định hoạt lực amylase. Dùng pipet hút 1ml dịch sau nuôi cấy cho vào ống eppendorf, sau đó đem li tâm ở To = 20oC, tốc độ 8000 vòng/phút, trong thời gian 20 phút.
Bƣớc 5: Nhỏ dịch
Nhỏ khoảng 100 – 150 µl dịch sau ly tâm vào lỗ thạch. Sau đó để trong tủ lạnh trong 2h, rồi để trong tủ ấm 30oC trong 24h.
Bƣớc 6: Kiểm tra hoạt tính sinh sinh amylase
Sau 24h lấy đĩa thạch ra khỏi tủ ấm, sử dụng lugol để thử hoạt tính phân giải tinh bột của amylase. Đo vòng phân giải để xác định hoạt lực sinh enzym của vi sinh vật.
2.2.7. Phương pháp xác định ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự
sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn
2.2.7.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Các chủng vi sinh vật được nuôi trong môi trường MPB ở điều kiện nhiệt độ khác nhau. Các mốc nhiệt độ là 15oC, 20oC, 25oC, 30oC, 35oC và 40oC. Môi trường sau khi được cấy giống được ni trong tủ lắc 150 vịng/phút trong 24h.
Sau đó xác định khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase ở từng mốc nhiệt độ khác nhau. Khả năng sinh trưởng của vi sinh vật được xác định bằng cách đo OD để xác định độ đục quang học, nhờ đó tính tốn được lượng sinh khối vi sinh vật. Khả năng sinh tổng hợp amylase được đánh giá bằng phương pháp thạch đục lỗ [6].
2.2.7.2. Ảnh hưởng của pH
Để xác định ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase của vi sinh vật, ta tiến hành nuôi vi sinh vật trên môi trường MPB, nhiệt độ 300C ở các mức pH = 3, pH = 4, pH = 5, pH = 6, pH = 7, pH = 8 và pH = 9.
Sau đó tiến hành xác định khả năng sinh trưởng bằng phương pháp đo OD. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp amylase bằng phương pháp thạch đục lỗ [6]
2.2.8. Phương pháp xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý hố của các chủng vi khuẩn chủng vi khuẩn
2.2.8.1. Phương pháp nhuộm Capsule
Chuẩn bị các lam kính sạch, lau cồn để khử trùng. Nhỏ một giọt nước vô trùng lên trên lam kính. Lấy một lượng nhỏ VSV hịa tan đều trong giọt nước vô trùng, để
khơ tự nhiên. Nhỏ dung dịch tím gentian lên tiêu bản VSV, dàn đều, dể dung dịch tím trong vịng 2 phút. Rửa sạch dung dịch tím bằng dung dịch CuSO4 20%. Lấy giấy thấm khơ bề mặt lam kính và soi dưới kính hiển vi [6,8,18].
2.2.8.2. Phương pháp nhuộm Gram
Chủng vi khuẩn để nhuộm Gram được ni cấy trong vịng 24 giờ ở nhiệt độ 300C. Nhỏ một giọt nước vơ trùng lên lam kính đã khử trùng và lau sạch bằng cồn. Lấy một lượng nhỏ mẫu hòa đều vào giọt nước trên lam kính, hơ khơ. Sau đó, nhỏ một giọt dung dịch tím kết tinh lên lam kính và gạt đều lên phần dịch mẫu đã hơ khô. Để 3 phút sau đó rửa bằng nước rồi hơ khơ. Nhuộm tiếp bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa lại bằng nước, hơ khơ. Tiếp đó ngâm phần lam kính có chứa mẫu và đã được nhuộm màu trong cồn 30 giây, rửa và hơ khô. Tiếp tục nhỏ một giọt Fuchsin lên, gạt đều để 1 phút, rửa, hơ khơ và soi dưới kính hiển vi.
Nhóm vi khuẩn Gram dương có đặc tính khơng bị dung mơi hữu cơ (etanol) tẩy phức chất màu giữa tím kết tinh và iốt, kết quả cuối cùng sẽ bắt màu tím. Nhóm vi khuẩn Gram âm bị dung mơi tẩy màu thuốc nhuộm đầu do đó sẽ bắt màu thuốc nhộm bổ sung đỏ tía với thuốc nhuộm Fuchsin [6,18]
2.2.9. Phương pháp xác định nhu cầu oxy hóa học (COD)
Hóa chất: K2Cr2O7, dung dịch AgSO4/H2SO4, chỉ thị Ferrion và dung dịch
chuẩn độ FAS 0.1M.
Cách tiến hành: Lấy vào ống COD 2,5ml mẫu; thêm 1,5ml dung dịch K2Cr2O7 0,01667M; 3,5ml dung dịch AgSO4/H2SO4. Đậy chặt nắp đun ở 1500C trong 2 giờ. Sau đó để nguội về nhiệt độ phịng. Cho hỗn hợp sang bình chứa lớn hơn để tiến hành chuẩn độ, tráng ống nghiệm bằng nước cất nhiều lần. Trước khi chuẩn độ thêm vào dung dịch 0,05 – 0,1ml (tương đương 1 – 2 giọt) dung dịch Ferroin. Chuẩn độ với dung dịch FAS: màu của dung dịch chuyển từ xanh lá cây sang nâu đỏ [20].
Trong đó: A là thể tích FAS sử dụng đối với mẫu trắng, ml
B là thể tích FAS sử dụng đối với mẫu thử nghiệm, ml M là nồng độ mol của FAS, mol/l
8000: đương lượng của oxy x 1000mg/l Vmẫu: thể tích mẫu đã dùng, ml
2.2.10. Phương pháp xác định nito tổng số
Hóa chất: dung dịch K – Cu – SO4, NaOH 40%, H3BO3 2%, HCl 0,1N và metyl xanh – đỏ.
Phân tích nito tổng số trong mẫu:
- Phá mẫu: Lấy 50ml mẫu, cho thêm 50ml dung dịch phá mẫu K – Cu – SO4 đun sơi đến khi khói trắng bốc lên.
- Để nguội định mức thành 100ml. Cho thêm 50ml dung dịch NaOH 40%. - Dung dịch hấp thụ: 50ml dung dịch H3BO3 2% và 5ml dung dịch metyl xanh – đỏ.
- Lắp vào thiết bị chưng cất: Thiết lập máy chưng cất trong 5 phút. Dung dịch hấp thụ chuyển từ màu tím sang màu xanh.
- Chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,1N. Chuẩn độ đến khi màu tím xuất hiện và ghi lại thể tích HCl đã dùng [16]
Cơng thức tính:
Trong đó:
0: thể tích mẫu ban đầu, ml
mN = V1 – V2 V0 x CHCl x 14,01 x 1000 COD (mg/l) = (A – B) x M x 8000 Vmẫu
V1: thể tích HCl chuẩn độ, ml V2: thể tích HCl của mẫu trắng, ml
CHCl: nồng độ HCl, N
14,01: khối lượng nguyên tử nito.
2.2.11. Phương pháp xác định photpho tổng số
- Phá mẫu: Dùng pipet lấy lượng mẫu thử tối đa là 40 ml vào các bình nón 100 ml. Nếu cần, pha loãng bằng 40 ml ± 2 ml nước. Thêm 4 ml dung dịch kali peroxodisulfat và đun sơi nhẹ trong khoảng 30 min. Duy trì thể tích khoảng 25 ml đến 35 ml bằng nước. Làm nguội, chỉnh pH từ 3 đến 10 bằng dung dịch kali hydroxyt hoặc axit sulfuric rồi chuyển sang bình dung tích 50 ml, pha lỗng bằng nước tới khoảng 40 ml. Cũng có thể vơ cơ hóa trong 30 min trong nồi hấp ở nhiệt độ từ 1150C đến 1200C [17].
- Lập đường chuẩn: Dùng pipet, chuyển lượng thể tích thích hợp, như 1,0 ml; 2,0ml; 3.0 ml; 4,0 ml; 5,0 ml; 6,0 ml; 7,0 ml; 8,0 ml; 9,0 ml; và 10,0 ml dung dịch chuẩn octophosphat vào các bình nón dung tích 100 ml, pha loãng tới khoảng 40 ml với nước. Khoảng nồng độ octophosphat của dung dịch này từ p = 0,04 mg/l tới 0,4 mg/l. Tiếp tục tiến hành phá mẫu.
Thêm vào mỗi bình 1 ml axit ascobic và sau 30 giây, 2 ml dung dịch II axit molipdat. Định mức lên 50ml. So màu với mẫu trắng ở bước sóng 720nm được bảng số liệu hiển thị quan hệ giữa nồng độ với mật độ quang, lập đường chuẩn từ bảng số liệu thu được.
- Xác định photpho tổng số trong mẫu: Thêm vào mỗi bình mẫu đã phá 1 ml axit ascobic và sau 30 giây, 2 ml dung dịch II axit molipdat. Định mức lên 50ml. So màu với mẫu trắng ở bước sóng 720nm [17].
2.2.12. Phương pháp xác định amoni
Hóa chất: Dung dịch Natri – Kali – Tactrat, thuốc thử Nessler, NH4Cl.
Lập đường chuẩn: Pha dung dịch gốc có nồng độ 1mg/l N – NH4+. Chuẩn bị các ống nghiệm có đánh số từ 0 – 7 với các nồng độ tương tự 0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1,0. Sau đó thêm vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch Natri – Kali – Tactrat và 1ml dung dịch thuốc thử Nessler. Định mức lên 50ml. Lắc đều, để yên 5
Xác định N – NH4+ trong nước: Lấy 50ml mẫu nước đã loại bỏ đục, thêm vào 1 ml dung dịch Natri – Kali – Tactrat. Sau đó thêm 1ml dung dịch thuốc thử