CHƢƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Định danh nấm N8 và N11 dựa vào trình tự gen ITS
Để định danh hai chủng nấm đến loài, vùng gen ITS1-5,8S-ITS2 được giải trình tự và phân tích.
DNA tổng số của hai chủng nấm N8 và N11 được tách chiết thành công theo phương pháp của Sambrook và Russell (2001) và bảo quản ở 4oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo (Hình 6a). DNA tổng số được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại gen vùng ITS của hai chủng nấm, và sản phẩm PCR thu được có chất lượng tốt với một băng rõ duy nhất trên gel điện di, có kích thước khoảng 500 bp (Hình 6b).
Hình 6. Điện di kiểm tra DNA tổng số (a) và sản phẩm PCR khuếch đại
vùng ITS của chủng nấm N11 và N8 trên gel agarose 1% (b), trong đó: M là marker và giếng 1 và 2 là sản phẩm PCR của N11 và N8.
Bảng 3. Mức độ tương đồng của gen mã hóa vùng ITS của chủng nấm N11
với các chủng trên GenBank
Chủng nấm so sánh Mã số truy cập trên GenBank Độ tƣơng đồng (%) P. digitatum FRR1313 AY373910 99 P. digitatum CBS 112082 KJ834506 99 Penicillium sp. 13 BRO-2013 KF367511 99 P. digitatum NRRL 786 AF033471 99 P. digitatum M2 HQ850929 99 P. digitatum CBS 136.65 AB479307 99
So sánh trình tự gen ITS1-5,8S-ITS2 rDNA (562 bp) của chủng N11 với các trình tự tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cơ sở GenBank bằng cơng cụ BLAST trên NCBI cho thấy, trình tự ITS của chủng nấm nghiên cứu có độ tương đồng cao với các chủng nấm thuộc loài P. digitatum như: P. digitatum FRR1313 (99%); P. digitatum CBS 112082 99%. Dựa vào các đặc điểm sinh học và phân tích trình tự
gen vùng ITS cho thấy, chủng nấm N11 có độ tương đồng cao và có nhiều đặc điểm gần gũi với loài Penicillium digitatum nên chủng nấm này được đặt tên là
Penicillium digitatum N11.
Trình tự gen chủng N8 có kích thước là 444 bp được so sánh với các trình tự trên GenBank cho thấy có độ tương đồng cao (100%) với Colletotrichum
gloeosporioides, như C. gloeosporioides ETHCTR069 (KT282690.1) và C.
gloeosporioides ETHCTR004 (KT282633.1). Dựa vào các đặc điểm sinh học và
phân tích trình tự gen vùng ITS cho thấy, chủng nấm N8 có độ tương đồng cao và có nhiều đặc điểm gần gũi với lồi Colletotrichum gloeosporioides nên chủng nấm này được đặt tên là Colletotrichum gloeosporioides N8.
Bảng 4. Mức độ tương đồng của gen mã hóa vùng ITS của chủng nấm N8
với các chủng trên GenBank
Chủng nấm so sánh Độ tƣơng đồng (%)
Mã số truy cập trên GenBank
Colletotrichum gloeosporioides ETHCTR069 100 KT282690.1
Colletotrichum gloeosporioides ETHCTR004 100 KT282633.1
Colletotrichum gloeosporioides T146 99 FJ459931.1
Colletotrichum gloeosporioides A677 99 KX463049.1
Colletotrichum gloeosporioides A720 99 KU529807.1
Hai chủng nấm N11 và N8 được sử dụng làm chủng kiểm định trong các nghiên cứu tiếp theo.