2.3.1. Phân lập nấm từ cam bệnh
Chọn ngẫu nhiên 10 quả nhiễm nấm. Các trái cây này được rửa sach bằng nước, khử trùng bề mặt bằng natri hypochlorite (NaClO) 0,5% trong 2 ÷ 5 phút. Mẫu vỏ quả được cắt bằng dụng cụ tiệt trùng từ ranh giới giữa mô khỏe và mơ bệnh (3 ÷ 5 mm) và đặt trên mơi trường phân lập PDA ủ ở 25 ± 1oC trong 5 ngày. Các dòng nấm phân lập được làm sạch và giữ trên môi trường PDA để nghiên cứu sâu hơn [48].
2.3.2. Xác định đặc điểm nuôi cấy và phân loại nấm dựa trên phân tích trình tự gen ITS gen ITS
Xác định đặc điểm sinh học của nấm Penicillium [14, 16, 30] và
Colletotrichum [46] thơng qua sự phát triển của sợi nấm, hình dạng khuẩn lạc nấm,
đặc điểm cơ quan sinh sản và bào tử phân sinh.
DNA tổng số nấm được tách chiết dựa trên phương pháp tách chiết theo phương pháp của Sambrook [36]. Vùng gen ITS-rDNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR từ DNA tổng số, sử dụng cặp mồi ITS1 (5‟-TCC GTA GGTGAA CCT GCG G-3‟) và ITS4 (5‟-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3‟) theo Ni và cộng sự [25].
2.3.3. Khảo sát khả năng ức chế của nano kim loại đối với nấm ở giai đoạn bào tử
Tính nhạy cảm của nấm ở giai đoạn bào tử đối với nano được xác định theo MIC (Minimum Inhibitory Concentration) và MFC (Minimum Fungal Concentration). Trong đó, MIC là nồng độ ức chế tối thiểu, và MFC là nồng độ tối thiểu diệt nấm. Sử dụng phương pháp pha lỗng ½ để thu được các nồng độ nano khảo sát, với mật độ bào tử nấm nghiên cứu là 106 CFU/ml. Sau 72 giờ nuôi lắc ở 25ᵒ C, quan sát sự phát triển của vi sinh vật. Nồng độ nano thấp nhất không phát hiện bằng mắt thường sự phát triển của nấm được xác định là MIC. Hút 100 μl từ các thí nghiệm có nồng độ nano ≥ MIC để trang đĩa và ủ ở 25ᵒ C. MFC được định nghĩa là nồng độ thấp nhất có <3 khuẩn lạc nấm xuất hiện [4].
2.3.4. Khảo sát khả năng ức chế của nano kim loại đối với nấm ở giai đoạn sinh dưỡng
Hoạt động của nano kim loại kháng nấm ở giai đoạn sinh dưỡng được đánh giá trên đĩa thạch Petri. Môi trường đĩa thạch PDA được bổ sung nano kim loại ở các nồng độ khác nhau:
nano Cu: 100, 250, 500, 1000, 1500 ppm nano Ag: 10, 30, 50, 100, 200, 300, 400 ppm nano AgH: 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 ppm
Các đĩa nấm được nuôi trong 5 ngày ở 25°C được sử dụng làm giống. Các khoanh thạch nấm giống đường kính 6 mm được đặt vào trung tâm đĩa thạch nano. Đối chứng (-) không bổ sung nano và đối chứng (+) sử dụng Carbendazim. Ủ đĩa ở 25°C và theo dõi đường kính sinh trưởng của nấm theo thời gian. Hiệu quả ức chế của nano kim loại với nấm được tính tốn theo cơng thức sau:
Tỷ lệ ức chế (%) = x 100
Trong đó R: đường kính khuẩn lạc nấm trên đĩa đối chứng và r là đường kính khuẩn lạc nấm trên đĩa thí nghiệm [22].
2.3.5. Xác định tác dụng của nano kim loại ở các nồng độ khác nhau lên nấm
gây bệnh trên cam
Thí nghiệm bố trí gồm 6 cơng thức với các nồng độ nano kim loại. Mỗi cơng thức lặp 3 quả.
Quy trình xâm nhiễm cam: Rửa nước sạch → Khô bề mặt → Tạo vết thương trên bề mặt quả → Nhiễm nấm bệnh với mật độ nghiên cứu 106 bào tử nấm → Nhúng vào dung dịch nano kim loại → Khô bề mặt → Đóng thùng carton → Lưu trữ ở 25oC.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh theo thời gian.
Tỷ lệ bệnh (%) =
Số quả bị bệnh
x 100 Tổng số quả thí nghiệm
2.3.6. Đánh giá chất lượng của quả cam bảo quản sau xử lý nano ở quy mơ phịng thí nghiệm phịng thí nghiệm
Quy trình xử lí cam: Cắt tỉa cuống → Rửa nước sạch → Khô bề mặt → Bọc màng có bổ sung nano kim loại → Khơ bề mặt → Đóng thùng carton → Bảo quản 10 ÷ 12oC.
Thí nghiệm được thiết kế hồn tồn ngẫu nhiên, mỗi cơng thức được lặp lại 3 lần và trong cùng một thời điểm.
Theo dõi và lấy mẫu phân tích trong thời gian bảo quản 40 ngày, tần suất 10 ngày/lần. Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng gồm: hàm lượng chất khơ hịa tan tổng số TSS (◦Brix), hàm lượng axit chuẩn độ được (%), hàm lượng đường tổng số (%), tỷ lệ thối hỏng (%), tỷ lệ hao hụt khối lượng (%), tỷ lệ mốc cuống (%), hàm lượng vitamin C (mg/100g).