1. PHẠM VI ÁP DỤNG
Phƣơng pháp này dùng phân lập Salmonella spp. trong thủy sản và môi trƣờng nuôi thủy sản.
2. ĐỊNH NGHĨA
2.1. Salmonella spp có khoảng 2300 kiểu huyết thanh (serotype) và thuộc họ vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae, Salmonella spp có một số đặc điểm chính sau:
Gram âm, hình que, kỵ khí tùy nghi.
Di động bằng tiên mao (flagella) trừ những biến thể do đột biến không thể di động và có một kiểu huyết thanh là khơng di động.
Hầu hết các chủng Salmonella có khả năng biến dƣỡng glucose và manitol để tạo ra acid nhƣng khơng có khả năng phân giải saccharose và lactose để tạo ra acid.
Salmonella không tạo indol và không phân giải ure. Phần lớn các
chủng sinh H2S và có enzyme Lysine decarboxylase và Ornithine decarboxylase.
Theo Kauffmann White, giống Salmonella đƣợc chia thành nhiều kiểu huyết thanh dựa theo kháng nguyên O (thân), kháng nguyên H (flagella) và kháng nguyên Vi (capsule). Ngoài ra, Một số kiểu huyết thanh nhƣ Enteritidis.Typhi, Paratyphi và Typhimurium đƣợc xếp loại theo pha.
3. NGUYÊN TẮC
Để phát hiện Salmonella cần 4 bƣớc. Đó là: [1]Tiền tăng sinh (pre-
enrichment); [2] Tăng sinh chọn lọc (selective enrichment); [3] Phân lập (isolation) và [4] Khẳng định (confirmation)
Thiết bị, mơi trƣờng ni cấy và quy trình phân tích trong phƣơng pháp này dựa theo phƣơng pháp ISO 6579 “Microbiology of Food and animal feeding
stuffs – Horizontal method for the detection of Salmonella spp.” 4th
ed., 2002.
4.KIỂM SỐT CHẤT LƢỢNG
Phải thực hiện phân tích chủng dƣơng Salmonella cùng với mẫu.
5. KHUYẾN CÁO VỀ AN TOÀN
Do Salmonella spp. gây bệnh ở ngƣời nên việc phân lập và xác định phải đƣợc thực hiện bởi những kiểm nghiệm viên đã đƣợc đào tạo và đƣợc giám sát phù hợp.
Các môi trƣờng ni cấy, hóa chất bị nhiễm khuẩn đều phải đƣợc hấp thanh trùng (121oC/15 phút) trƣớc khi loại bỏ.
Các quy trình cấy chuyền và khẳng định đều phải thực hiện trong tủ vô trùng (biosafety)
Khi pha chế môi trƣờng nuôi cấy, phải đeo khẩu trang để tránh hít phải các bụi mơi trƣờng.
Tránh để bất kỳ vật nào trong miệng (bút chì, bút mực, ngón tay…) và tuyệt đối không đƣợc dùng miệng lấy mẫu bằng pipette.
Không đƣợc để những vật dụng bị nhiễm vi sinh vật trên bàn nhƣ que cấy, đầu tip hoặc pipette thủy tinh… mà phải đƣợc thanh trùng nhƣ hơ lửa đối với que cấy hoặc để trong dung dịch khử trùng (đầu típ hoặc pipette thủy tinh)
Mặt bàn nơi phân tích phải đƣợc khử trùng bằng cồn 70o
trƣớc và sau khi thực hiện
Nếu ống nghiệm chứa chủng vi sinh vật bị vỡ hoặc bị đổ trên mặt bàn hoặc sàn nhà. Dùng khăn giấy phủ khắp lên nơi ấy và lau sạch. Sau khi lau, ngâm khăn giấy này trong dung dịch khử trùng khoảng 15 phút trƣớc khi loại bỏ.
6. MƠI TRƢỜNG NI CẤY & DỊCH PHA LỖNG
6.1. Buffered peptone water – BPW.
6.2. Rappaport-Vassiliadis soy peptone broth – RV.
6.3. Muller- Kauffmann tetrathionate novobiocin broth (MKTTn) 6.4. Xylose lysine desoxycholate agar – XLD.
6.5. Brilliant green phenol red lactose sucrose agar – BPLS. 6.6. Nutrient agar – NA
6.7. Triple sugar iron agar – TSI 6.8. Urea agar
6.9. Urea 6.10. ONPG 6.11. MR - VP
6.12. Tryptone/tryptophan (Tryptone, DL-Tryptophan, NaCl) 6.13. Thuốc thử Kovacs’ 6.14. Decarboxylase base 6.15. Lysine 6.16. Creatine 6.17. -Naphthol. 6.18. Ethanol 96% 6.19. KOH.
6.20. Nƣớc muối sinh lý (NaCl, H20) 6.21. Kháng huyết thanh đa giá O, H, Vi
6.22. Nutrient agar bán rắn – NAB (Meat extract, Peptone, Agar)
7. THIẾT BỊ CHÍNH & VẬT DỤNG
7.10 Thiết bị đồng nhất mẫu.
7.11 Kính hiển vi quang học, lam và lamelle
7.12 Cân điện tử (d=0.1g)
7.13 Đĩa Petri, bao PE và ống nghiệm vô trùng, viết lông kim 7.14 Micropipette 100 l – 1000 l, đầu tip vô trùng
7.15 Kéo, nẹp vô trùng để lấy mẫu 7.16 Cồn 70o và cồn tuyệt đối 7.17 Que cấy vòng và que cấy thẳng 7.18 Tủ ủ 37.0 1,0 o C 7.19 Tủ ủ 44.0 0,5 o C 7.20 Bể điều nhiệt 42.0 1.0 oC và 45.0 1.0 o C. 8. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
8.1. Phƣơng pháp phát hiện Salmonella spp. theo ISO 6579: 2007 8.1.1. Xử lý mẫu
Cân 1 phần mẫu vào 9 phần BPW (Cân 25 gam mẫu cho vào bao PE vô trùng thêm vào 225 ml môi trƣờng BPW). Đồng nhất mẫu trong khoảng 30 – 60 giây tùy theo đặc điểm của mẫu.
8.1.2. Tiền tăng sinh
Sau đồng nhất, dịch mẫu đƣợc ủ trong tủ ủ 37 1 oC / 182 giờ.
8.1.3. Tăng sinh chọn lọc
Môi trƣờng tăng sinh chọn lọc chứa những thành phần chọn lọc, cho phép
Salmonella spp. sinh sản và ức chế sự sinh trƣởng cạnh tranh của hệ vi sinh vật
khác hiện diện trong mẫu. Các môi trƣờng dùng trong giai đoạn này gồm RV và MKTTn
Đối với môi trƣờng RV: chuyển 0.1ml dịch tiền tăng sinh sau khi ủ sang ống nghiệm chứa 10 ml. Ủ trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 41.5 1 0C (trong bể điều nhiệt hoặc tủ ấm và cần chú ý nhiệt độ tối đa không vƣợt quá 42.5 0
C trong 24 + 3 giờ.)
Đối với môi trƣờng MKTTn: chuyển 1ml dịch tiền tăng sinh sau khi ủ sang ống nghiệm chứa 10ml MKTTn. Ủ trong tủ ủ ở 37 1 0
C trong 24 + 3 giờ.
Mục đích của giai đoạn này nhằm phân biệt vi khuẩn Salmonella spp. và các vi khuẩn không phải Salmonella spp. thông qua đặc điểm của khuẩn lạc.
Từ các ống MKTTn và RV sau khi ủ 24 + 3 giờ, dùng que cấy vòng, cấy ria dịch mẫu sang hai môi trƣờng thạch XLD và BPLS. Lật ngƣợc các đĩa và ủ trong tủ ủ ở 37.01.00
C trong 24 + 3 giờ. Sau khi ủ 24 + 3 giờ xem xét sự hiện diện khuẩn lạc điển hình
8.1.4.1. Trên môi trƣờng XLD: Khuẩn lạc Salmonella spp. điển hình có
vùng trong, hơi nhuốm đỏ do chất chỉ thị màu thay đổi trong mơi trƣờng, và có tâm đen. Những kiểu huyết thanh tạo ít hoặc khơng tạo H2S nhƣ S. Paratyphi B, S. Senftenberg, S. Pullorum cho khuẩn lạc màu đỏ có hoặc khơng có tâm đen. Những khuẩn lạc màu đỏ cũng có thể do một số dịng của các lồi Proteus và Pseudomonas.
8.1.4.2. Trên môi trƣờng BPLS: Khuẩn lạc Salmonella spp. điển hình hơi
trong có màu hơi đỏ trong môi trƣờng.
8.1.5. Khẳng định
Đƣợc thực hiện thơng qua các thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm huyết thanh. Chọn ít nhất một khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ điển hình trên mỗi đĩa của từng loại môi trƣờng để tiến hành thử nghiệm.
Mỗi khuẩn lạc đƣợc cấy ria ở trên bề mặt một đĩa chứa môi trƣờng NA sao cho khuẩn lạc mọc rời. Ủ các đĩa sau khi cấy trong tủ ủ 37.0 1 0
C /24 + 3 giờ. Sau khi ủ, sinh khối từ các khuẩn lạc trên đĩa NA đƣợc dùng để khẳng định thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh kháng.
8.1.5.1. Thử nghiệm sinh hóa 8.1.5.1.1. TSI Agar
a) Thực hiện: dùng que cấy vòng, lấy lƣợng nhỏ sinh khối trên NA, cấy ria trên mặt nghiêng ống thạch TSI. Sau đó dùng que cấy nhọn, lấy sinh khối đâm sâu xuống đáy ống (tránh chạm đáy). Ủ các ống ở 37,0 1 0
C /24 + 3 giờ. b) Kết quả: sự chuyển màu trên TSI sau 24 giờ ủ đƣợc mô tả nhƣ sau Đáy ống
Vàng …..……… Glucose dƣơng tính Đỏ …………. Glucose âm tính Đen ………… Hình thành H2S
Có bọt khí hoặc nứt mặt thạch do sinh khí từ glucose Mặt nghiêng
Vàng …………… Lactose và hoặc Sucrose dƣơng tính Đỏ ……………… Lactose và Sucrose âm tính
Trên TSI sau khi cấy Salmonella có một số đặc điểm sau: mặt nghiêng có tính kiểm thể hiện màu đỏ, đáy ống có tính acid thể hiện màu vàng, có bọt khí và 90 % có màu đen do sinh H2S.
8.1.5.1.2. Urea agar
a) Thực hiện: dùng que cấy vòng, lấy lƣợng nhỏ sinh khối trên NA, cấy ria trên mặt nghiêng ống thạch Urea. Ủ các ống trong tủ ủ 37.0 1.0 0
C /24 + 3 giờ. Nếu phản ứng dƣơng tính, sự phân cắt ure giải phóng NH3 làm thay đổi màu của chỉ thị phenol-red sang hồng kế đó là đỏ hồng. Phản ứng thƣờng rõ ràng sau 2-4 giờ ủ.
b) Kết quả: dƣơng tính khi màu đỏ hồng khắp cả ống (Proteus mirabilisProteus vulgaris , Morganella morganii, Providencia rettgeri) Âm tính
khi mơi trƣờng không đổi màu (vàng cam).
8.1.5.1.3. L-Lysin decarboxylation
a) Thực hiện: dùng que cấy vòng, lấy lƣợng nhỏ sinh khối trên NA ống nghiệm chứa khoảng 5 ml môi trƣờng Lysin decarboxylation, phủ lên trên một lớp mỏng dầu khoáng. Ủ các ống trong tủ ủ 37.0 1.0 0
C /24 + 3 giờ
b) Kết quả: Dƣơng tính khi mơi trƣờng có màu tím, đục. Âm tính khi mơi trƣờng có vàng
8.1.5.1.4. β-galactosidase
a) Thực hiện: dùng que cấy vòng, lấy lƣợng nhỏ sinh khối trên NA ống nghiệm chứa 0.25 ml nƣớc muối sinh lý, để đĩa ONPG vào ủ ở 37.0 1 0
C /24 + 3 giờ.
Kết quả: dƣơng tính khi mơi trƣờng có màu vàng. Âm tính: mơi trƣờng
có màu nhƣ ban đầu
8.1.5.1.5. Voges-Proskauer (VP)
Chuyển sinh khối từ NA vào ống nghiệm chứa 5ml môi trƣờng VP. Ủ các ống này trong tủ ủ 37.0 10
C /24 + 3 giờ.
Sau khi ủ, thêm hai giọt dung dịch creatine lắc đều, thêm tiếp ba giọt dung dịch 1-naphthol lắc đều và sau đó hai giọt dung dịch KOH lắc đều.Trong vịng 15 phút nếu phản ứng dƣơng tính mơi trƣờng trong ống nghiệm sẽ chuyển thành màu hồng cho tới đỏ tƣơi.
8.1.5.1.6. Indole
Chuyển sinh khối từ NA vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng tryptone (Pepton from casein) ủ ở 37,0 1 0
C/ 24 + 3 giờ.
Sau khi ủ thêm 1ml thuốc thử Kovacs. Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện vịng màu đỏ trên bề mặt ống nghiệm, màu nâu vàng là âm tính.
Trƣớc khi thực hiện thử nghiệm kháng huyết thanh, cần loại trừ các kiểu huyết thanh có khả năng tự ngƣng kết. Cách thực hiện nhƣ sau:
Kiểm tra khả năng tự ngƣng kết của vi khuẩn bằng cách nhỏ 1 giọt nƣớc muối sinh lý lên phiến kính sạch. Sau đó, dùng que cấy vòng lấy một lƣợng sinh khối vừa đủ trên môi trƣờng NA, trộn đều nhẹ nhàng trong vòng 30- 60 giây thành huyền dịch, quan sát kết quả trên nền tối, tốt nhất là sử dụng kính lúp .
Đọc kết quả, nếu có những hạt do ngƣng kết thì ngừng phản ứng, nếu huyền dịch vẫn đục đều thì tiến hành thực hiện phản ứng kháng huyết thanh với kháng nguyên O, H, Vi.
8.1.5.2.1. Thử ngƣng kết kháng nguyên O
Sử dụng khuẩn lạc thuần khơng có khả năng tự ngƣng kết, tiếp tục qui trình giống nhƣ thử nghiệm tự ngƣng kết, thay thế giọt nƣớc muối sinh lý bằng kháng huyết thanh O. Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện những hạt nhỏ trắng li ti, phản ứng âm tính khi huyền dịch vẩn đục.
8.1.5.2.2. Thử ngƣng kết kháng nguyên Vi
Sử dụng khuẩn lạc thuần khơng có khả năng tự ngƣng kết, tiếp tục qui trình giống nhƣ thử nghiệm tự ngƣng kết, thay thế giọt nƣớc muối sinh lý bằng kháng huyết thanh Vi. Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện những hạt hạt nhỏ trắng li ti, phản ứng âm tính khi huyền dịch vẩn đục
8.1.5.2.3. Thử ngƣng kết kháng nguyên H
Sử dụng khuẩn lạc thuần khơng có khả năng tự ngƣng kết cấy vào mơi trƣờng thạch bán rắn NAB ủ 37.0 1 0
C /24 + 3 giờ. Sau khi ủ lấy sinh khối trên thạch mềm tiếp tục qui trình giống nhƣ thử nghiệm tự ngƣng kết, thay thế giọt nƣớc muối sinh lý bằng kháng huyết thanh H. Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện những hạt nhỏ trắng li ti, phản ứng âm tính khi huyền dịch vẩn đục.
8.1.6. Diễn giải kết quả
Không thể kết luận dƣơng tính hoặc âm tính Salmonella spp. trong mẫu
thử khi chỉ dựa vào hoặc thử nghiệm sinh hóa hoặc chỉ dựa vào thử nghiệm huyết thanh kháng. Do:
Thử nghiệm sinh hóa khơng thể phát hiện tất cả các kiểu huyết thanh, ngồi ra các dịng Salmonella spp. không phải luôn luôn cho phản ứng điển hình.
Thử nghiệm huyết thanh kháng dựa vào phản ứng ngƣng kết kháng nguyên O, kháng nguyên H hoặc kháng nguyên Vi. Tuy nhiên, Salmonella spp. có thể thay đổi hình dáng khuẩn lạc từ trơn (smooth) sang nhăn (rough). Dạng nhăn là do đột biến do ngăn sự tổng hợp polysaccharide. Do đó, khơng có chuỗi nhánh O, mất đi khả năng ngƣng kết kháng nguyên O. Nếu phản ứng ngƣng kết kháng nguyên O là dƣơng tính, khi đó chƣa thể kết luận là Salmonella spp. đƣợc vì có một số lồi khác (E.coli, Citrobacter, Shigella và Enterobacter) hoặc có
cùng chung một số kháng nguyên O hoặc cũng có những kháng nguyên tƣơng tự với kháng nguyên của Salmonella spp.
Do đó, để kết luận mẫu dƣơng tính hoặc âm tính Salmonella spp., cần phải kết hợp kết quả của hai thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh kháng. Khi kết hợp, sẽ có những trƣờng hợp sau:
Trƣờng hợp 1. Các thử nghiệm sinh hóa đều nghiệm đúng nhƣ trong
bảng 1, khơng có tự ngƣng kết và phản ứng ngƣng kết H hoặc O hoặc Vi dƣơng tính. Trƣờng hợp này khẳng định là mẫu dƣơng tính Salmonella spp.
Trƣờng hợp 2. Phản ứng ngƣng kết H và O và Vi đều âm tính và
không nghiệm đúng hết tất cả các thử nghiệm sinh hóa trong bảng 1. Trƣờng hợp này khẳng định là mẫu âm tính Salmonella spp.
Trƣờng hợp 3. Các thử nghiệm sinh hóa đều nghiệm đúng nhƣ trong
Bảng 1 nhƣng phản ứng ngƣng kết H, O và Vi đều âm tính. Trƣờng hợp này có thể nghi ngờ là dƣơng tính Salmonella spp. Khi đó thực hiện lại thử nghiệm nhƣ sau: lấy sinh khối trên môi trƣờng TSI cấy sang đĩa thạch môi trƣờng di động bằng cách đâm sâu nhƣng không đƣợc chạm đáy. Ủ trong tủ ủ 37 oC/ 24 giờ. Nếu di động, khi đó cấy chuyển sinh khối trên môi trƣờng di động sang môi trƣờng NAB và lặp lại thử nghiệm ngƣng kết kháng nguyên H. Nếu vi khuẩn vẫn không di động sau 24 giờ ủ, ủ tiếp 5 ngày, nếu vẫn khơng di động thì khi đó đến phịng thí nghiệm kiểm chứng để xác định cuối cùng.
Trƣờng hợp 4. Các thử nghiệm sinh hóa đều khơng nghiệm đúng nhƣ
trong Bảng 1 nhƣng phản ứng ngƣng kết H hoặc O hoặc Vi cho kết quả dƣơng tính. Trƣờng hợp này có thể nghi ngờ là dƣơng tính Salmonella spp. cấn kiểm
chứng để xác định cuối cùng.
Bảng 1: diễn giải kết quả sinh hóa của Salmonella spp.
Stt Thử nghiệm hoặc cơ
chất Phản ứng sinh hóa và kháng huyết thanh của Salmonella spp. % Dƣơng tính 1 Glucose (TSI) + 100 2 Khí từ glucose(TSI) + 92 3 Lactose (TSI) - 1 4 Sucrose (TSI) - 1 5 H2S (TSI) + 92 6 Ure - 1 7 Lysin decarboxylase + 95 8 VP - 0 9 Indole - 1 10 β-galactosidase - 2