1. PHẠM VI ÁP DỤNG
Phƣơng pháp này dùng phân lập Vibrio spp. trong thủy sản và môi trƣờng nuôi thủy sản.
2. ĐỊNH NGHĨA
Vibrio spp. là vi khuẩn tạo khuẩn lạc điển hình trên mơi trƣờng rắn chọn
lọc, có đặc tính sinh hóa đặc trƣng khi thử theo phƣơng pháp ISO/TS 21872 – 1,2 : 2007.
3. NGUYÊN TẮC
Để phát hiện Vibrio spp. gồm 3 bƣớc: tăng sinh, phân lập, khẳng định. Thiết bị, môi trƣờng ni cấy và quy trình phân tích trong phƣơng pháp này dựa theo phƣơng pháp ISO/TS 21872 – 1,2 : 2007.
4. KIỂM SỐT CHẤT LƢỢNG.
Quy trình phân tích đƣợc thực hiện phân tích chủng chuẩn Vibrio cholerae hoặc Vibrioparahaemolyticus cùng với mẫu.
5. KHUYẾN CÁO VỀ AN TOÀN
Do một số dòng V. cholera gây bệnh ở ngƣời (O1 và O139) nên việc phân lập và xác định phải đƣợc thực hiện bởi những kiểm nghiệm viên đã đƣợc đào tạo và đƣợc giám sát phù hợp.
Hấp thanh trùng các vật liệu trong quy trình phân tích
Các quy trình cấy chuyền và khẳng định đều phải thực hiện trong tủ vô trùng (biosafety).
Khi pha chế môi trƣờng nuôi cấy, phải đeo khẩu trang để tránh hít phải các bụi môi trƣờng.
Không đƣợc hút mẫu bằng miệng
Mặt bàn nơi phân tích phải đƣợc khử trùng bằng cồn 70o
trƣớc và sau khi thực hiện.
6. MƠI TRƢỜNG NI CẤY & DỊCH PHA LỖNG
6.1. Alkaline Peptone water – APW.
6.2. Thiosulphate citrate bile salt sucrose agar – TCBS. 6.3. Cellobiose – Colistin (CC) agar hoặc TSAT
6.4. T1N1agar 6. 5. Oxidase
6.7. Bộ nhuộm Gram (Crystal Violet, Ethanol 95%, Ammonium oxalate, Saffarin, Iodine, Potassium iodine)
7. THIẾT BỊ CHÍNH & VẬT DỤNG
7.32 Thiết bị đồng nhất mẫu.
7.33 Kính hiển vi quang học, lam và lamelle
7.34 Cân điện tử (d=0.1g)
7.35 Đĩa Petri, bao PE và ống nghiệm vô trùng, viết lông kim 7.36 Micropipette 100 l – 1000 l, đầu tip vô trùng
7.37 Kéo, nẹp vô trùng để lấy mẫu 7.38 Cồn 70o và cồn tuyệt đối 7.39 Que cấy vòng và que cấy thẳng 7.40 Tủ ủ 37.0 1,0 o C 7.41 Tủ ủ 44.0 0,5 o C 7.42 Bể điều nhiệt 42.0 1.0 oC và 45.0 1.0 o C. 8. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
8.1. Phƣơng pháp phát hiện Vibrio spp. theo ISO/TS 21872 – 1,2:
2007
8.1.1. Xử lý mẫu
Cân 1 phần mẫu vào 9 phần APW (25g mẫu cho vào bao PE vô trùng thêm vào 225ml APW). Đồng nhất mẫu trong khoảng 30 – 60 giây tùy theo đặc điểm của mẫu.
8.1.2. Tăng sinh lần 1
Dịch mẫu sau khi đồng nhất đƣợc ủ trong tủ ủ 37 oC1 oC / 61 giờ (đối với sản phẩm đông lạnh) hoặc 41.5 o
C 1 oC / 61 giờ (đối với sản phẩm tƣơi, khô hoặc ƣớp muối).
8.1.3. Tăng sinh lân 2
Sau khi ủ hút 1 ml vào ống nghiệm có chứa 10ml APW ủ 41.5 oC1 o C / 181 giờ.
8.1.4. Phân lập
Giai đoạn phân lập đƣợc thực hiện đồng thời trên hai môi trƣờng thạch TCBS và CC agar hoặc TSAT.
Từ dịch mẫu ở 8.1.2.2 và 8.1.2.3, dùng que cấy vịng, cấy ria dịch mẫu sang hai mơi trƣờng thạch TCBS và CC agar. Lật ngƣợc các đĩa và ủ trong tủ ủ ở 37.01.0 0
C trong 24 + 3 giờ. Sau khi ủ 24 + 3 giờ xem xét sự hiện diện khuẩn lạc điển hình.
Trên môi trƣờng TCBS: Vibrio spp. tạo khuẩn lạc màu xanh hoặc màu vàng.
Trên môi trƣờng CC agar: Vibrio spp. tạo khuẩn lạc màu tím xanh.
8.1.5. Khẳng định
Trên mỗi đĩa nếu có khuẩn lạc điển hình chọn ít nhất 3 khuẩn lạc điển hình cấy ria sang mơi trƣờng T1N1agar. Ủ đĩa qua đêm ở 37.0 oC, sau đó thực hiệc các phản ứng sinh hóa sau:
8.1.5.1. Phản ứng oxidase
a) Thực hiện: Dùng vòng cấy, chuyển sinh khối từ đĩa T1N1agar sang giấy lọc đã tẩm ƣớt thuốc thử oxidase (1% N,N,N,N’- tetramethyl-p- phenylenediamine.2HCl).
b) Kết quả: Dƣơng tính khi màu xanh tía xuất hiện trong vịng 10 giây, âm tính khi khơng xuất hiện màu xanh tía. Vibrio spp. cho kết quả oxidase dƣơng tính.
8.1.5.2. Kiểm tra dƣới kính hiển vi 8.1.5.2.1. Nhuộm Gram
Cố định mẫu.
Đối với sinh khối trên mơi trƣờng rắn: dùng vịng cấy vô trùng lấy lƣợng nhỏ sinh khối của khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch không chọn lọc đã ủ 18-24 giờ, để lên miếng lam vô trùng chứa 1 giọt nƣớc muối vơ trùng. Dùng vịng cấy trải đều dịch mẫu ở tâm lam. Hơ nhẹ trên ngọn lửa bằng cách đƣa miếng lam qua lại vài lần trên đầu ngọn lửa.
Đối với sinh khối trên môi trƣờng lỏng: lấy sinh khối từ dịch mẫu đã ủ 18-24 giờ và trải đều và hơ lửa nhƣ trên.
Nhuộm
Nhỏ dung dịch crystal violet phủ khắp mẫu đã cố định trên miếng lam. Để yên trong 1 phút. Rửa lam bằng nƣớc cất trong khoảng 5 giây. Để khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn lửa nhƣ ở mục cố định mẫu.
Nhỏ dung dịch Lugol phủ khắp dịch mẫu. Để yên trong khoảng 1 phút. Rửa miếng lam bằng nƣớc cất trong khoảng 5 giây. Để khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn lửa nhƣ ở mục cố định mẫu.
Để nghiêng miếng lam. Nhỏ từng giọt dung dịch khử màu. Dừng lại khi không cịn thấy chất màu trơi theo dung dịch khử màu và vùng dịch mẫu cố định có màu xanh-hơi xám. Rửa miếng lam bằng nƣớc cất trong khoảng 5 giây. Để khô tự nhiên.
Phủ dung dịch Safranin lên vùng dịch mẫu cố định. Để yên trong 1 phút. Rửa miếng lam bằng nƣớc cất trong khoảng 5 giây. Để khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn lửa nhƣ ở mục cố định mẫu.
Nhỏ 1 giọt dầu nhúng chìm và xem dƣới kính hiển vi ở vật kính 100X. Kết quả. Vibrio spp. có đặc điểm Gram âm, mỏng, hình dấu phẩy.
8.1.5.2.2. Xem di động
Từ khuẩn lạc trên đĩa TCBS, chuyển sinh khối sang ống nghiệm chứa khoảng 5 ml APW. Ủ trong tủ ủ ở 37 o
C/ 1 – 6 giờ. Sau khi ủ, nhỏ một giọt dịch lên miếng lam sạch. Đậy miếng lamelle và kiểm tra di động dƣới kính hiển vi. Dƣơng tính khi có di động.
8.1.5.3. Sử dụng glucose
a) Thực hiện: dDùng que cấy vòng, lấy lƣợng nhỏ sinh khối trên T1N1agar, cấy ria trên mặt nghiêng ống thạch TSI. Sau đó dùng que cấy nhọn, lấy sinh khối đâm sâu xuống đáy ống (tránh chạm đáy). Ủ các ống trong tủ ủ 37,0 10
C /24 + 3 giờ.
b) Kết quả. Sự chuyển màu trên TSI sau 24 giờ ủ đƣợc mô tả nhƣ sau.
Đáy ống
Vàng …..……… Glucose dƣơng tính Đỏ …………. Glucose âm tính Đen ………… Hình thành H2S
Có bọt khí hoặc nứt mặt thạch do sinh khí từ glucose
Mặt nghiêng
Vàng …………… Lactose hoặc và Sucrose dƣơng tính Đỏ ……………… Lactose và Sucrose âm tính
8.1.5.4.Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn O 129.
a) Thực hiện: dùng que cấy vòng, lấy lƣợng nhỏ sinh khối trên T1N1 agar cấy ria trên đĩa TSA 2 % NaCl, sau đó đặt đĩa O 129 150µl và đĩa O 129 10µl lên vùng cấy. Ủ các các đĩa trong tủ ủ 37.0 1.0 0
C /18-24 giờ.
b) Kết quả: dƣơng tính khi xuất hiện vùng ức chế, âm tính khi khơng xuất hiện vùng ức chế.