Phƣơng pháp phân lập Aeromonas spp

1. PHẠM VI ÁP DỤNG

Phƣơng pháp này dùng để phân lập Aeromonas spp. trong thủy sản và môi trƣờng nuôi thủy sản.

2. ĐỊNH NGHĨA

Aeromonas spp là vi khuẩn thuộc họ Vibrionaceae, là nhóm vi khuẩn

gram âm, hình que có kích thƣớc 0,3-1,0 x 1,0-4,0 µm, di động đƣợc nhờ roi ở cực thể. Phản ứng lên men và oxy hóa đƣờng, oxidase, catalase dƣơng tính và kháng với O/129 (Inglis et al., 1993). Aeromonas spp. đƣợc tìm thấy trong nƣớc các ao hồ ni và những ao ngồi tự nhiên (Swann et al., 1989).

3. NGUYÊN TẮC

Để phát hiện Aeromanas spp. cần 3 bƣớc. Đó là: [1]Tăng sinh [2] Phân

lập (isolation) và [3] Khẳng định (confirmation)

5. KIỂM SOÁT CHẤT LƢỢNG

Các mơi trƣờng, hóa chất dùng cho giai đoạn tăng sinh, khẳng định sinh hóa phải đƣợc làm ấm trƣớc bằng cách để trong tủ ủ ở nhiệt độ phân tích trƣớc khi thực hiện.

Phải thực hiện phân tích chủng dƣơng cùng với mẫu.

6. KHUYẾN CÁO VỀ AN TỒN

6.1. Các mơi trƣờng sau ni cấy, hóa chất bị nhiễm khuẩn đều phải đƣợc hấp thanh trùng (121oC/15 phút) trƣớc khi loại bỏ.

6.2. Khi pha chế môi trƣờng ni cấy, phải đeo khẩu trang để tránh hít phải các bụi mơi trƣờng.

6.3. Tránh để bất kỳ vật nào trong miệng (bút chì, bút mực, ngón tay…) và tuyệt đối không đƣợc dùng miệng lấy mẫu bằng pipette.

6.4. Không đƣợc để những vật dụng bị nhiễm vi sinh vật trên bàn nhƣ que cấy, đầu tip hoặc pipette thủy tinh… mà phải đƣợc thanh trùng nhƣ hơ lửa đối với que cấy hoặc để trong dung dịch khử trùng (đầu típ hoặc pipette thủy tinh).

6.5. Mặt bàn nơi phân tích phải đƣợc khử trùng bằng cồn 70o

trƣớc và sau khi thực hiện.

6.6. Nếu ống nghiệm chứa chủng vi sinh vật bị vỡ hoặc bị đổ trên mặt bàn hoặc sàn nhà. Dùng khăn giấy phủ khắp lên nơi ấy và lau sạch. Sau khi lau, ngâm khăn giấy này trong dung dịch khử trùng khoảng 15 phút trƣớc khi loại bỏ.

7. MƠI TRƢỜNG NI CẤY & DỊCH PHA LỖNG

6.2. Pseudomonas aeromonas selective agar – GSP. 6.3. TSA

6.4. Oxidase

6.5. O129 (10µg; 150 µg)

6.6. Bộ nhuộm Gram (Crystal Violet, Ethanol 95 %, Ammonium oxalate, Saffarin, Iodine, Potassium iodine)

7. THIẾT BỊ CHÍNH & VẬT DỤNG

7.21 Thiết bị đồng nhất mẫu.

7.22 Kính hiển vi quang học, lam và lamelle 7.23 Cân điện tử (d=0.1g)

7.24 Đĩa Petri, bao PE và ống nghiệm vô trùng, viết lông kim 7.25 Micropipette 100 l – 1000 l, đầu tip vô trùng

7.26 Kéo, nẹp vô trùng để lấy mẫu 7.27 Cồn 70o

và cồn tuyệt đối 7.28 Que cấy vòng và que cấy thẳng 7.29 Tủ ủ 37.0  1,0 o C 7.30 Tủ ủ 44.0  0,5 o C 7.31 Bể điều nhiệt 42.0  1.0 oC và 45.0  1.0 o C. 8. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

8.1. Phƣơng pháp phát hiện Aeromonas spp. theo NWFHS - 2009 8.1.1. Xử lý mẫu

Cân 1 phần mẫu vào 9 phần PBS (25g mẫu cho vào bao PE vô trùng thêm vào 225ml PBS). Đồng nhất mẫu trong khoảng 30 – 60 giây tùy theo đặc điểm của mẫu.

Dịch mẫu sau khi đồng nhất đƣợc ủ trong tủ ủ 37oC1 oC / 243 giờ.

8.1.2. Phân lập

Giai đoạn phân lập đƣợc thực hiện trên môi trƣờng thạch GSP agar.

Từ dịch mẫu ở 8.1.4.1, dùng que cấy vòng, cấy ria dịch mẫu sang môi trƣờng thạch GSP agar. Lật ngƣợc các đĩa và ủ trong tủ ủ ở 37.01.00

C trong 24 + 3 giờ. Sau khi ủ 24 + 3 giờ xem xét sự hiện diện khuẩn lạc điển hình.

Trên mơi trƣờng GSP agar: Aeromonas spp. tạo khuẩn lạc màu vàng.

Trên mỗi đĩa nếu có khuẩn lạc điển hình chọn ít nhất 3 khuẩn lạc điển hình cấy ria sang mơi trƣờng TSA. Ủ đĩa qua đêm ở 37.0oC, sau đó thực hiệc các phản ứng sinh hóa sau:

8.1.3.1. Phản ứng oxidase

a) Thực hiện: dùng vòng cấy, chuyển sinh khối từ đĩa TSA sang giấy lọc đã tẩm ƣớt thuốc thử oxidase (1% N,N,N,N’- tetramethyl-p- phenylenediamine.2HCl).

b) Kết quả: dƣơng tính khi màu xanh tía xuất hiện trong vịng 10 giây, âm tính khi khơng xuất hiện màu xanh tía. Aeromonas spp. cho kết quả oxidase dƣơng tính.

8.1.3.2. Kiểm tra dƣới kính hiển vi 8.1.3.2.1. Nhuộm Gram

Cố định mẫu.

Đối với sinh khối trên môi trƣờng rắn: Hơ đỏ vòng cấy, làm nguội trên thành ống nghiệm, Lấy lƣợng nhỏ sinh khối của khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch không chọn lọc sau 18-24 giờ ủ, để lên miếng lam (đã khử trùng bằng cồn 70o

) chứa 1 giọt nƣớc muối vơ trùng. Dùng vịng cấy trải đều dịch mẫu ở tâm miếng lam. Hơ nhẹ trên ngọn lửa bằng đƣa miếng lam qua lại vài lần trên đầu ngọn lửa. Đối với sinh khối trên môi trƣờng lỏng: lấy sinh khối trong dịch mẩu sau 18-24 giờ ủ và trải đều và hơ lửa nhƣ trên.

Nhuộm

Nhỏ dung dịch crystal violet phủ khắp mẫu đã cố định trên miếng lam. Để yên trong 1 phút. Rửa miếng lam bằng nƣớc cất trong khoảng 5 giây. Để khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn lửa nhƣ ở mục cố định mẫu.

Nhỏ dung dịch Lugol phủ khắp dịch mẫu. Để yên trong khoảng 1 phút. Rửa miếng lam bằng nƣớc cất trong khoảng 5 giây. Để khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn lửa nhƣ ở mục cố định mẫu.

Để nghiêng miếng lam. Nhỏ từng giọt dung dịch khử màu. Dừng lại khi khơng cịn thấy chất màu trơi theo dung dịch khử màu và vùng dịch mẫu cố định có màu xanh-hơi xám. Rửa miếng lam bằng nƣớc cất trong khoảng 5 giây. Để khô tự nhiên.

Phủ dung dịch Safranin lên vùng dịch mẫu cố định. Để yên trong 1 phút. Rửa miếng lam bằng nƣớc cất trong khoảng 5 giây. Để khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn lửa nhƣ ở mục cố định mẫu.

Nhỏ 1 giọt dầu immersion oil và xem dƣới kính hiển vi ở vật kính 100X Kết quả. Aeromonas spp. có đặc điểm Gram âm.

Từ khuẩn lạc trên đĩa GSP agar, chuyển sinh khối sang ống nghiệm chứa khoảng 5 ml BHI. Ủ trong tủ ủ ở 37 o

C/ 1 – 6 giờ. Sau khi ủ, nhỏ một giọt dịch lên miếng lam sạch. Đậy miếng lamelle và kiểm tra di động dƣới kính hiển vi. Dƣơng tính khi có di động.

8.1.3.3. Sử dụng glucose

a) Thực hiện: Dùng que cấy vòng, lấy lƣợng nhỏ sinh khối trên TSA, cấy ria trên mặt nghiêng ống thạch TSI. Sau đó dùng que cấy nhọn, lấy sinh khối đâm sâu xuống đáy ống (tránh chạm đáy). Ủ các ống trong tủ ủ 37,0  1 0

C /24 + 3 giờ.

b) Kết quả: Sự chuyển màu trên TSI sau 24 giờ ủ đƣợc mô tả nhƣ sau:

Đáy ống

Vàng …..……… Glucose dƣơng tính Đỏ …………. Glucose âm tính Đen ………… Hình thành H2S

Có bọt khí hoặc nứt mặt thạch do sinh khí từ glucose

Mặt nghiêng

Vàng …………… Lactose hoặc và Sucrose dƣơng tính Đỏ ……………… Lactose và Sucrose âm tính .

8.1.3.4. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn O 129

a) Thực hiện: Dùng que cấy vòng, lấy lƣợng nhỏ sinh khối trên TSA cấy ria trên đĩa TSA, sau đó đặt đĩa O 129 150 µg và đĩa O 129 10 µg lên vùng cấy. Ủ các các đĩa trong tủ ủ 37.0  1.00

C /18-24 giờ.

b) Kết quả: Dƣơng tính khi xuất hiện vùng ức chế, âm tính khi khơng xuất hiện vùng ức chế.