1. PHẠM VI ÁP DỤNG
Phƣơng pháp này dùng để thử nghiệm tính kháng kháng sinh của các vi sinh vật trong thủy sản và môi trƣờng nuôi thủy sản.
2. NGUYÊN TẮC
Kháng sinh tẩm trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Meuler-hinton có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm. Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh đƣợc biểu hiện bằng đƣờng kính các vịng vơ khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh.
3. KIỂM SOÁT CHẤT LƢỢNG
Các mơi trƣờng, hóa chất dùng cho giai đoạn thử nghiệm tính kháng kháng sinh phải đƣợc làm ấm trƣớc bằng cách để trong tủ ủ ở nhiệt độ phân tích trƣớc khi thực hiện.
Các đĩa kháng sinh phải đƣợc bảo quản trong lọ tối màu và phải để khơ trƣớc khi phân tích.
Phải thực hiện phân tích chủng dƣơng cùng với mẫu.
4. KHUYẾN CÁO VỀ AN TOÀN
4.1 Các mơi trƣờng sau ni cấy, hóa chất bị nhiễm khuẩn đều phải đƣợc hấp thanh trùng (121oC/15 phút) trƣớc khi loại bỏ.
1.1 Khi pha chế môi trƣờng nuôi cấy, phải đeo khẩu trang để tránh hít phải các bụi mơi trƣờng.
1.2 Tránh để bất kỳ vật nào trong miệng (bút chì, bút mực, ngón tay…) và tuyệt đối không đƣợc dùng miệng lấy mẫu bằng pipette.
1.3 Không đƣợc để những vật dụng bị nhiễm vi sinh vật trên bàn nhƣ que cấy, đầu tip hoặc pipette thủy tinh… mà phải đƣợc thanh trùng nhƣ hơ lửa đối với que cấy hoặc để trong dung dịch khử trùng (đầu típ hoặc pipette thủy tinh)
1.4 Mặt bàn nơi phân tích phải đƣợc khử trùng bằng cồn 70o trƣớc và sau khi thực hiện
1.5 Nếu ống nghiệm chứa chủng vi sinh vật bị vỡ hoặc bị đổ trên mặt bàn hoặc sàn nhà. Dùng khăn giấy phủ khắp lên nơi ấy và lau sạch. Sau khi lau, ngâm khăn giấy này trong dung dịch khử trùng khoảng 15 phút trƣớc khi loại bỏ.
5. MÔI TRƢỜNG/ HOÁ CHẤT/ THUỐC THỬ VÀ CHỦNG CHUẨN
5.1 Môi trƣờng thạch Muller Hinton Agar – MHA. 5.2 Mơi trƣờng pha lỗng Saline peptone water – SPW.
5.3 Độ đục chuẩn (McFarland): độ đục chuẩn 0,5 McFarland phải đƣợc chuẩn bị và kiểm định chất lƣợng trƣớc khi làm thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh. Dịch độ đục chuẩn đƣợc hàn kín để chống bay hơi và bảo quản trong bóng tối để sử dụng trong vịng 6 tháng. Độ đục chuẩn McFarland đƣợc sử dụng để điều chỉnh độ đục của huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn cho thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh. Kiểm tra độ chính xác của độ đục chuẩn 0,5 Mcfaland bằng máy đo độ đục ở bƣớc sóng 625nm, chỉ số OD phải nằm trong khoảng 0,08-0,1.
5.4 Khoanh giấy kháng sinh: sử dụng các khoanh giấy có chứa các loại kháng sinh nhƣ sau: FFC 30 µg, OTX 30 µg, ENR 5 μg, NOR 10 μg, SXT 1.25/23.75 μg, SDM 10 μg, AMO 10 μg, AMO 30 μg và GN 10 μg.
5.5 Chủng chuẩn sử dụng: chủng vi khuẩn Escherchia coli ATCC 25922.
6. THIẾT BỊ CHÍNH & VẬT DỤNG
6.1. Đĩa Petri, bao PE và ống nghiệm vô trùng, viết lông kim 6.2. Micropipette 100 l – 1000 l, đầu tip vô trùng
6.3. Cồn 70o
và cồn tuyệt đối 6.4. Que cấy vòng và que cấy trang 6.5. Tủ ủ 37.0 1,0 o
C
6.6. Bể điều nhiệt 42.0 1.0 oC và 45.0 1.0 o C.
8. QUY TRÌNH THỬ NGHIỆM TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH 8.1. Chuẩn bị mẫu
Các chủng vi khuẩn sau phân lập đƣợc giữ ở -20 0C trong mơi trƣờng BHI có chứa 20% glycerol cho đến khi thử nghiệm khả năng kháng kháng sinh. Trƣớc khi sử dụng cấy và kiểm tra lại các đặc tính sinh hóa của chủng.
Các chủng vi khuẩn sau phân lập, trƣớc khi thử nghiệm cần đƣợc cấy sang môi trƣờng TSA dƣới dạng đĩa hay thạch nghiêng (đối với Vibrio spp. thì mơi
trƣờng bổ sung thêm 1% NaCl). Ủ các chủng trong tủ ủ ở 37oC 1oC/ 242 giờ.
8.2. Pha loãng
Sau khi ủ ở 8.1, dùng que cấy vơ trùng lấy 1 khuẩn lạc hịa tan vào 2 ml nƣớc muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy trộn vortex.
Độ đục của dịch khuẩn sẽ đƣợc so sánh với độ đục chuẩn 0,5 McFarland dƣới nền giấy trắng có kẻ các vạch đen.
Chú ý: Cần phải trộn đều ống đục chuẩn trƣớc khi dùng. Nếu dịch vi khuẩn khơng có cùng độ đục với độ đục chuẩn 0,5 McFarland, có thể điều chỉnh độ đục bằng cách cho thêm nƣớc muối sinh lý hoặc cho thêm vi khuẩn.
Pha lỗng 100 lần dịch khuẩn có độ đục tƣơng đƣơng độ đục McFaland để đƣợc dịch khuẩn nồng độ 106
8.3. Cấy chuyển sang MHA
Chuyển 1ml dịch khuẩn nồng độ 106
vi khuẩn /ml ở 8.2. sang đĩa thạch MHA. Trải đều dịch mẫu trên bề mặt thạch bằng que cấy thủy tinh hình tam giác, hút dịch khuẩn thừa bỏ đi. Để các đĩa ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút để dịch mẫu hấp thụ vào bề mặt môi trƣờng.
Chú ý : luôn luôn phải làm song song thử nghiệm với chủng dƣơng Escherichia coli ATCC 25922 để kiểm tra chất lƣợng của qui trình.
8.4. Đặt khoanh giấy tẩm kháng kháng sinh
Lấy khoanh giấy tẩm kháng sinh ra khỏi tủ lạnh, không đƣợc mở nắp, để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ để ổn định và làm giảm hơi nƣớc tích tụ trên khoanh giấy kháng sinh.
Dùng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt nhẹ nhàng từng khoanh giấy kháng sinh lên đĩa thạch MHA (8.3.). Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch.
Chú ý:
Khoanh giấy kháng sinh đƣợc đặt càng sớm càng tốt, trong vòng 15 phút sau khi láng vi khuẩn lên đĩa thạch.
Không nên đặt quá 6 khoanh giấy lên đĩa thạch 90mm.
Không di chuyển khoanh giấy khi đã tiếp xúc với mặt thạch để tránh các vịng ức chế chồng chéo lên nhau và có thể gây sai số khi đo vòng ức chế.
Lộn ngƣợc các đĩa thạch và ủ ấm ở 370
C trong vòng 18-20 giờ.
8.5. Đọc kết quả
Sau khi ủ (8.4), lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi lại kích thƣớc vịng vơ khuẩn (dùng thƣớc đo từ mặt sau của đĩa và không đƣợc mở nắp) của chủng chuẩn.
So sánh kết quả của chủng chuẩn với bảng chuẩn. Nếu phù hợp nghĩa là qui trình thực hiện đúng, tiếp tục đọc kết quả vịng vơ khuẩn của chủng thử nghiệm. Nếu khơng phù hợp, qui trình thực hiện chƣa đúng hoặc hóa chất sinh phẩm hỏng, không phù hợp, cần phải tiến hành lại.
So sánh kích thƣớc vịng vơ khuẩn của chủng thử nghiệm với vòng ức chế chuẩn (phụ lục 2), sau đó ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh đƣợc thử nghiệm nhƣ là: nhạy cảm (S), trung bình (I) và kháng (R).
Nếu có hiện tƣợng khuẩn lạc mọc trong vịng ức chế thì đây có thể xuất hiện sự thay đổi tính kháng của vi khuẩn hoặc do các huyền dịch vi khuẩn bị trộn lẫn vào với nhau. Các khuẩn lạc này nên đƣợc nuôi cấy, phân lập và thử nghiệm lại tính nhạy cảm với kháng sinh.
TT Tên kháng sinh
Hàm lƣợng (theo CLSI,
2010)
E.coli + Salmonella spp. Vibrio spp. Aeromonas spp.
R (mm) I (mm) S (mm) R (mm) I (mm) S (mm) R (mm) I (mm) S (m m) 1 Florphenicol 30 µg ≤14 15 - 18 ≥19 ≤14 15 - 18 ≥19 ≤14 15 - 18 ≥19 2 Oxytetracyline 30 µg ≤14 15 - 18 ≥19 ≤14 15 - 18 ≥19 ≤14 15 - 18 ≥19 3 Enrofloxacine 5 μg ≤16 17 - 20 ≥23 ≤16 17 - 20 ≥23 ≤16 17 - 20 ≥23 4 Norfloxacin 10 μg ≤12 13 - 16 ≥17 ≤12 13 - 16 ≥17 ≤12 13 - 16 ≥17 5 Trimethoprim- sulfamethoxazol e 1.25/23.75 μg ≤10 11 - 15 ≥16 ≤10 11 - 15 ≥16 ≤10 11 - 15 ≥16 6 Sulfadimidine 10 μg ≤10 11 - 15 ≥16 ≤10 11 - 15 ≥16 ≤10 11 - 15 ≥16 7 Ampicilline 10 μg ≤13 14 - 16 ≥17 ≤13 14 - 16 ≥17 ≤13 14 - 16 ≥17 8 Amoxycilline 30 μg ≤13 14 - 17 ≥18 ≤13 14 - 17 ≥18 ≤13 14 - 17 ≥18 9 Trimethoprim 5 μg ≤10 11 - 15 ≥16 ≤10 11 - 15 ≥16 ≤10 11 - 15 ≥16 10 Gentamycine 10 μg ≤12 13 - 14 ≥15 ≤12 13 - 14 ≥15 ≤12 13 - 14 ≥15