Các bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
1 94 5 phút 2 94 1 phút 35 46 30 giây 72 1 phút 3 72 10 phút 4 25 kết thúc
Phản ứng được thực hiện trên máy PCR. Sau khi kết thúc phản ứng PCR, sản phẩm được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
2.3.5. Phương pháp tạo dòng gen
Để tách dịng và xác định trình tự đoạn gen nhận được sau phản ứng PCR đã tinh sạch được gắn vào vector pTZ57R/T dưới sự xúc tác của T4-ligase theo phương pháp đầu dính (pTZ57R/T là vector tách dịng gen, mạch thẳng có kích thước là 2886bp, được thiết kế với đầu dính là 1 nucleotid thymine sử dụng để tách dòng gen trực tiếp từ sản phẩm PCR, do sản phẩm PCR có mang hai đầu A, đặc tính của taq polymerase gắn thêm 1 nucleotid A). Hỗn hợp được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10b bằng phương pháp shock nhiệt để tạo plsamid tái tổ hợp.
Sau quá trình biến nạp, các tế bào vi khuẩn E. coli chứa vector tái tổ hợp
được nuôi phục hồi và dịch tế bào được nuôi trên đĩa petri môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin ở 370C qua đêm để chọn lọc. Trong môi trường chọn lọc này theo lý thuyết các tế bào mang vector sẽ sống được trên môi trường chứa kháng sinh, các tế bào không mang vector sẽ chết.
Sau khi nuôi cấy chọn ngẫu nghiên trên môi trường nuôi cấy một khuẩn lạc màu xanh và một vài khuẩn lạc màu trắng vào trong mơi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin (nồng độ 100µl/ml), lắc qua đêm ở nhiệt độ 370C, 200 vịng/phút. Sau đó tiến hành tách plasmid tái tổ hợp, tinh sạch và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Hình 2.1. Cấu trúc vector tách dịng pTZ57R/T
1. Hệ thống chọn lọc thứ nhất: gen kháng kháng sinh Ampicilin mang gen mã hóa cho enzyme β-Lactamase phân hủy kháng sinh cho phép chọn lọc tế bào vi khuẩn chứa vector pTZ57R/T và ngăn ngừa sự nhiễm của vi khuẩn khác; 2. Hệ
thống chọn lọc thứ hai Lac- Operon: chứa gen Lac-Z mã hóa cho enzyme β- galactosidase, khi khơng có đoạn xen vào trong vector thì gen có khả năng tạo ra enzyme β-galactosidase lên men lactose. Nếu có đoạn xen vào trong vector thì
gen LacZ khơng hồn chỉnh do đó k thể tạo ra enzyme β-galactosidase và không lên men được lactose [10].
2.3.6. Phương pháp giải trình tự gen
Sau khi đã kiểm tra bằng điện di sản phẩm điện di sẽ được thôi gel và gửi đọc trình tự bằng máy giải trình tự tự động tại phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen – Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Theo phương pháp giải trình tự trên hệ thống máy giải trình tự thế hệ mới theo nguyên lý Sanger sử dụng các ddNTP có đánh dấu huỳnh quang.
Phương pháp này thực hiện dựa trên kỹ thuật phổ biến là “chain termination- kết thúc chuỗi” bằng việc sử dụng các deoxy nucleotide đã bị chỉnh sửa làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường. Nhóm 3’-OH đóng vai trị cho phép
①
gắn thêm một nucleotide mới vào chuỗi. Khi một ddNTP được thêm vào chuỗi, vì khơng có nhóm 3’-OH nên một nucleotide khơng được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại. Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn các dNTP vào mạch đơn của DNA để kéo dài mạch ở vị trí 3’- OH và dừng lại nếu gắn các ddNTP vào chuỗi.
Trong một phản ứng chứa cả dNTP và ddNTP nên sau phản ứng tổng hợp, hình thành các đoạn DNA có độ dài khác nhau do ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng. Dựa vào sự sai khác về độ dài các đoạn DNA hiển thị trên bản gel sau điện di để xác định trình tự trong gene. Kỹ thuật giải trình tự DNA tự động (Dye temination sequencing) sử dụng các ddNTP có đánh dấu huỳnh quang đã giúp cho việc sắp xếp trình tự DNA trở nên nhanh chóng và hiệu quả hơn. Mỗi loại ddNTP được gắn một màu có bước sóng phát xạ huỳnh quang khác nhau cho phép thực hiện giải trình tự trong một phản ứng duy nhất. Hệ thống điện di mao quản được sử dụng để đọc trình tự DNA một cách tự động. Cấu tạo của máy gồm 16 mao quản chứa gel polyacrylamide cho phép phân tích nhiều mẫu trong một lần điện di. Hệ thống detector gồm các camera có chùm tia laser đi qua nó để ghi nhận tín hiệu huỳnh quang một cách chính xác.
Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng và được camera ghi nhận và lưu lại thành một cường độ đỉnh sáng (peak) trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với nhau và phân tích thành trình tự của đoạn DNA [4].
Hình 2.2. Hình ảnh mơ tả q trình giải trình tự thế hệ mới theo nguyên lý Sanger sử dụng các ddNTP có đánh dấu huỳnh quang
2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả đọc trình tự được phân tích, xử lý bằng phần mềm Bioedit và phần mềm Blast trực tuyến để so sánh trình tự nucleotide.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết DNA tổng số của chủng Pseudomonas
Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số là một khâu rất quan trọng vì mọi cơng đoạn tiếp theo như nhân gen, chọn dịng và xác định trình tự nucleotide phụ thuộc vào chất lượng DNA tổng số ban đầu. Vì vậy, trong quá trình tách chiết phải đảm bảo sao cho DNA không bị đứt gãy bởi một số tác nhân cơ học và hố học.
Các chủng Pseudomonas được ni cấy trong mơi trường LB lỏng với điều kiện thích hợp trong 18 - 24 giờ và được tiến hành tách chiết DNA bằng cách phá vỡ màng tế bào và màng nhân sau đó loại bỏ các thành phần khơng mong muốn bằng dung dịch chloroform : isoamyl alcohol cuối cùng là tủa acid nucleic bằng isopropanol qua đêm, rửa tủa và hịa tủa thu được sau đó điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả được thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số của các chủng nghiên cứu
M: Marker 1kb; 1: chủng VTCC-B-657; 2: chủng QN1.
Qua hình 3.1 cho thấy, DNA tổng số tách chiết được của 2 chủng
Pseudomonas là một băng gọn có kích thước lớn hơn 10 kb so với marker. Sản
phẩm DNA ít bị đứt gãy có thể dùng cho các phản ứng phân lập gen bằng kỹ thuật PCR.
10 kb 3 kb 1kb
3.2. Phân lập gen azurin
Để phân lập gen azurin từ chủng VTCC-B-657 và QN1 bằng phản ứng PCR cho sản phẩm đặc hiệu chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR với khuôn được thiết kế dựa trên trình tự gen mã hóa protein azurin của chủng P. aeruginosa có mã số trên GeneBank M30389. Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng đã trình bày ở mục 2.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR được thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2 cho thấy sản phẩm PCR xuất hiện một băng đặc hiệu, tương đối đậm và rõ nét có kích thước khoảng 450 bp phù hợp với tính tốn lý thuyết. Như vậy, cặp mồi đặc hiệu cao với chủng VTCC-B-657 và QN1. Gen azurin của 2
chủng P. aeruginosa có thể đã được phân lập và khuếch đại bằng phản ứng PCR.
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen azurin
1: Đối chứng âm; 2: Sản phẩm PCR nhân gen azurin chủng VTCC-B-657; 3: Sản phẩm PCR nhân gen azurin chủng QN1; M: Maker 100bp.
3.3. Gắn gen vào vector nhân dòng và chọn dịng
Để tách dịng và xác định trình tự đoạn gen nhận được sau phản ứng PCR, sản phẩm PCR đã tinh sạch được gắn vào vector pTZ57R/T dưới sự xúc tác của T4-ligase. Hỗn hợp được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10b bằng phương pháp shock nhiệt để tạo plsamid tái tổ hợp.
Sau quá trình biến nạp, các tế bào vi khuẩn E. coli chứa vector tái tổ hợp
được nuôi phục hồi và dịch tế bào được nuôi trên đĩa petri môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin ở 370C qua đêm để chọn lọc. Trong môi trường chọn lọc này theo lý thuyết các tế bào mang vector sẽ sống được trên môi trường chứa kháng sinh, các tế bào không mang vector sẽ chết.
Một khuẩn lạc màu xanh và một vài dòng khuẩn lạc màu trắng xuất hiện được lựa chọn một cách ngẫu nhiên và ni vào trong mơi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin (nồng độ 100µl/ml), lắc qua đêm ở nhiệt độ 370C, 200 vịng/phút. Sau đó tiến hành tách plasmid tái tổ hợp, tinh sạch và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả được thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Hình ảnh điện di plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc sau biến nạp
1-2: plasmid các dòng khuẩn lạc trắng đĩa biến nạp chủng VTCC-B-657; 3-4: plasmid các dòng khuẩn lạc trắng đĩa biến nạp chủng QN1;
đc: đối chứng (plasmid tách từ dịng khuẩn lạc xanh).
Kết quả hình 3.3 cho thấy dịch plasmid ở giếng 1 và 3 có thể mang phân đoạn chèn nên có kích thước lớn hơn so với đối chứng. Plasmid ở giếng 2 và 4 không có đoạn chèn có kích thước tương đương với đối chứng. Plasmid ở giếng 1 và 3 đã được cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn HindIII và XbaI. Kết quả điện di sản phẩm cắt cho thấy xuất hai băng DNA. Một băng có kích thước khoảng gần 3000 bp tương ứng với vector pTZ57R/T, một băng có kích thước dưới 500 bp tương ứng với kích thước gen azurin (hình 3.4). Như vậy, plasmid tái tổ hợp này có thể
mang phân đoạn gen azurin chèn vào. Plasmid tái tổ hợp đã được tinh sạch và gửi đọc trình tự nucleotide.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt
1: sản phẩm cắt bằng HindIII và XbaI dòng plasmid tái tổ hợp mang gen azurin của chủng VTCC-B-657; 2: sản phẩm cắt bằng HindIII và XbaI dòng plasmid tái
tổ hợp mang gen azurin của chủng QN1; M: marker 1kb.
3.4. Phân tích trình tự gen azurin
3.4.1. Phân tích trình tự gen azurin của chủng VTCC-B-657
Kết quả đọc trình tự cho thấy, gen azurin của chủng P. aeruginosa VTCC-B- 657 có chiều dài 447 bp, kích thước này đúng với tính tốn lý thuyết khi thiết kế mồi (hình 3.5) và phù hợp với nghiên cứu của Nahi Yousif Yaseen và cộng sự đã cơng bố trước đó khi nghiên cứu sự xuất hiện của các loài Pseudomonas như một tác nhân gây bệnh viêm tai ở bệnh nhân Iraq [49]. Tuy nhiên, Sarwar và cộng sự lại cho kết quả khác, sự hiện diện của gen azurin được phát hiện ở 10 trong số 45 chủng
phân lập từ đất với gen azurin có kích thước là 545bp [41]. Một nghiên cứu khác của Đại học Calicut Ấn Độ cũng cho kết quả tương tự khi thực hiện phân lập gen
azurin sản xuất các chủng P. aeruginosa bản địa và xác nhận sự hiện diện của nó
bằng kỹ thuật phân tử, trong số 10 mẫu được chọn cho nghiên cứu này, 8 mẫu cho thấy sự hiện diện của gen azurin 545 bp [42]. Gần đây nhất vào đầu năm 2019,
458 bp khi đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng khuẩn của protein azurin tái tổ hợp từ Pseudomonas aeruginosa chống lại các loài vi khuẩn khác nhau [23].
ATGCTACGTAAACTCGCTGCCGTATCCCTGCTGTCCCTGCTCAGTGCG CCGCTGCTGGCTGCCGAGTGCTCGGTGGACATCCAGGGTAACGACCAG ATGCAGTTCAACACCAATGCCATCACCGTCGACAAGAGCTGCAAGCAG TTCACCGTCAACCTGTCCCACCCCGGCAACCTGCCAAAGAACGTCATG GGCCACAACTGGGTACTGAGCACCGCCGCCGACATGCAGGGCGTGGTC ACCGACGGCATGGCTTCCGGCCTGCACAAGGATTACCTGAAGCCCGAC GACAGCCGCGTCATCGCCCACACCAAGCTGATCGGCTCGGGCGAGAAG GACTCGGTGACCTTCGACGTCTCCAAGCTGAAGGAAGGCGAGCAGTAC ATGTTCTTCTGCACCTTCCCGGGCCACTCCGCGCTGATGAAGGGCACC CTGACCCTGAAGTGA 54 108 162 216 270 324 378 432 447
Hình 3.5. Trình tự gen azurin của chủng P. aeruginosa VTCC-B-657
Sử dụng phần mềm Blast so với các trình tự đã cơng bố trên GenBank, chúng tơi nhận thấy trình tự gen azurin mã hoá cho protein azurin của chủng P. aeruginosa VTCC-B-657 có độ tương đồng cao với một số gen mã hóa protein
azurin đã cơng bố.
Hình 3.6. Hình ảnh kết quả so sánh trình tự gen azurin của chủng P.
aeruginosa VTCC-B-657 trên phần mềm Blast
Phân tích trình tự bằng phần mềm DNA star cho thấy trình tự nucleotide của gen azurin chủng VTCC-B-657 có 97 nucleotide loại A (21,70%); 122 nucleotide loại G (27,29%); 76 nucleotide lại T (17,0%); 152 nucleotide loại C (34,0%). Số nucleotide loại A và T chiếm 38,7% và số nucleotide loại G và C chiếm 61,3%. Tỷ
lệ (A+T)/(G+C) bằng 0,63. Trình tự nucleotide tương đồng 99,6% so với gen azurin
chủng P. aeruginosa (mã số GenBank: M30389), sai khác 02 nucleotide ở vị trí 180 (G→A) và 265 (G→C) (hình 3.9).
3.4.2. Phân tích trình tự gen azurin của chủng QN1
Kết quả đọc trình tự cho thấy, gen azurin của chủng QN1 có chiều dài 447 bp, kích thước này đúng với tính tốn lý thuyết khi thiết kế mồi (hình 3.7).
ATGCTACGTAAACTCGCTGCGGTATCCCTGCTGTCCCTGCTCAGTGCG CCGCTGCTGGCTGCCGAGTGCTCGGTGGACATCCAGGGTAACGACCAG ATGCAGTTCAACACCAATGCCATCACCGTCGACAAGAGCTGCAAGCAG TTCACCGTCAACCTGTCCCACCCCGGCAACCTGCCGAAGAACGTCATG GGCCACAACTGGGTACTGAGCACCGCCGCCGACATGCAGGGCGTGGTC ACCGACGGCATGGCTTCCGGCCTGGACAAGGATTACCTGAAGCCCGAC GACAGCCGCGTCATCGCCCACACCAAGCTGATCGGCTCGGGCGAGAAG GACTCGGTGACCTTCGACGTCTCCAAGCTGAAGGAAGGCGAGCAGTAC ATGTTCTTCTGCACCTTCCCGGGCCACTCCGCGCTGATGAAGGGCACC CTGACCCTGAAGTGA 54 108 162 216 270 324 378 432 447
Hình 3.7. Trình tự gen azurin của chủng QN1
Sử dụng phần mềm Blast so với các trình tự đã cơng bố trên GenBank, chúng tơi nhận thấy trình tự gen azurin mã hố cho protein azurin của chủng QN1 có độ tương đồng cao với một số gen mã hóa protein azurin đã cơng bố. Phân tích trình tự bằng phần mềm DNA star cho thấy trình tự nucleotide của gen azurin chủng
QN1 có 117 nucleotide loại A (26,16%); 137 nucleotide loại G (30,65%); 88 nucleotide lại T (19,69%); 105 nucleotide loại C (23,49%). Số nucleotide loại A và T chiếm 45,86% và số nucleotide loại G và C chiếm 54,14%. Tỷ lệ (A+T)/(G+C) bằng 0,85. Trình tự nucleotide tương đồng 99,9% so với gen azurin chủng P. aeruginosa (mã số GenBank: M30389), sai khác 1 nucleotide ở vị trí 21 (G→C) (hình 3.9).
Hình 3.8. Hình ảnh kết quả so sánh trình tự gen azurin của chủng P.
aeruginosa QN1 trên phần mềm Blast
So sánh trình tự gen azurin chủng VTCC-B-657 với trình tự gen azurin của chủng QN1 có độ tương đồng 99,3%, sai khác 3 nucleotide ở vị trí 21 (G→C), 180 (C→A) và 265 (G→C) (hình 3.9).
Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide của gen azurin chủng VTCC-B-657, chủng QN1 với trình tự gen azurin của P. aeruginosa mã số M30389 trên
3.4.3. So sánh trình tự amino acid suy diễn
Protein azurin của chủng VTCC-B-657 có 148 amino acid. Mức độ tương đồng giữa trình tự amino acid suy diễn của protein azurin với trình tự amino acid suy diễn từ các trình tự gen azurin trên GenBank từ 69,6-99,3%. Trong đó tương đồng cao nhất (99,3%) với trình tự amino acid suy diễn từ trình tự nucleotide có mã số M30389 của chủng P. aeruginosa. Phân tích bằng phần mềm Bioedit cho thấy sự thay đổi nucleotide ở vị trí 21 và 180 trong trình tự gen azurin của chủng VTCC-B-657 khơng làm thay đổi amino acid, chỉ có sự thay đổi ở vị trí 265 đã làm thay đổi amino acid ở vị trí 89 (D→H) trong trình tự amino acid của protein azurin so với trình tự amino acid suy diễn từ trình tự nucleotide có mã số M30389 (hình 3.10). Kết quả của chúng tơi hồn toàn trùng khớp với một nghiên cứu khác của các nhà khoa học Hàn Quốc khi nghiên cứu về azurin tái tổ hợp từ P. aeruginosa gây chết tế bào apoptotic trong tế bào ung thư biểu mô vảy ở miệng,
nhóm nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật PCR nhân gen và sử dụng vector pGEMT làm vector tái tổ hợp và cho kết quả giải trình tự gen là 447 bp và trình tự amino acid suy diễn là 148 amino acid [31]. Tuy nghiên lại không trùng khớp với nghiên cứu trước đó của Đại học Cơng nghệ Chalmers, họ đã nhân bản và giải trình tự gen cấu trúc azurin P. aeruginosa và các vùng phịng vệ của nó. Trình tự DNA dự đốn một tiền protein với một peptit tín hiệu của 19 axit amin, tiếp theo là protein azurin trưởng thành 128 axit amin [13]. Hashimoto Wataru và cộng sự năm 2015 lại có một chút khác biệt, nghiên cứu chỉ ra rằng dạng tiền chất của azurin (148 amino acid) do P. aeruginosa tạo ra được chuyển thành dạng trưởng thành (Paz, 128 amino acid) thơng qua việc giải phóng một peptide tín hiệu (20 amino acid) qua màng trong [24].
Protein azurin của chủng QN1 có 148 amino acid. Mức độ tương đồng giữa trình tự amino acid suy diễn của protein azurin với trình tự amino acid suy diễn từ các trình tự gen azurin trên GenBank từ 69,6-100%. Trong đó tương đồng cao