CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.5. Phương pháp tạo dòng gen
Để tách dịng và xác định trình tự đoạn gen nhận được sau phản ứng PCR đã tinh sạch được gắn vào vector pTZ57R/T dưới sự xúc tác của T4-ligase theo phương pháp đầu dính (pTZ57R/T là vector tách dịng gen, mạch thẳng có kích thước là 2886bp, được thiết kế với đầu dính là 1 nucleotid thymine sử dụng để tách dòng gen trực tiếp từ sản phẩm PCR, do sản phẩm PCR có mang hai đầu A, đặc tính của taq polymerase gắn thêm 1 nucleotid A). Hỗn hợp được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10b bằng phương pháp shock nhiệt để tạo plsamid tái tổ hợp.
Sau quá trình biến nạp, các tế bào vi khuẩn E. coli chứa vector tái tổ hợp
được nuôi phục hồi và dịch tế bào được nuôi trên đĩa petri môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin ở 370C qua đêm để chọn lọc. Trong môi trường chọn lọc này theo lý thuyết các tế bào mang vector sẽ sống được trên môi trường chứa kháng sinh, các tế bào không mang vector sẽ chết.
Sau khi nuôi cấy chọn ngẫu nghiên trên môi trường nuôi cấy một khuẩn lạc màu xanh và một vài khuẩn lạc màu trắng vào trong mơi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin (nồng độ 100µl/ml), lắc qua đêm ở nhiệt độ 370C, 200 vòng/phút. Sau đó tiến hành tách plasmid tái tổ hợp, tinh sạch và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Hình 2.1. Cấu trúc vector tách dịng pTZ57R/T
1. Hệ thống chọn lọc thứ nhất: gen kháng kháng sinh Ampicilin mang gen mã hóa cho enzyme β-Lactamase phân hủy kháng sinh cho phép chọn lọc tế bào vi khuẩn chứa vector pTZ57R/T và ngăn ngừa sự nhiễm của vi khuẩn khác; 2. Hệ
thống chọn lọc thứ hai Lac- Operon: chứa gen Lac-Z mã hóa cho enzyme β- galactosidase, khi khơng có đoạn xen vào trong vector thì gen có khả năng tạo ra enzyme β-galactosidase lên men lactose. Nếu có đoạn xen vào trong vector thì
gen LacZ khơng hồn chỉnh do đó k thể tạo ra enzyme β-galactosidase và không lên men được lactose [10].