CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.6. Phương pháp giải trình tự gen
Sau khi đã kiểm tra bằng điện di sản phẩm điện di sẽ được thơi gel và gửi đọc trình tự bằng máy giải trình tự tự động tại phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen – Viện Cơng nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam. Theo phương pháp giải trình tự trên hệ thống máy giải trình tự thế hệ mới theo nguyên lý Sanger sử dụng các ddNTP có đánh dấu huỳnh quang.
Phương pháp này thực hiện dựa trên kỹ thuật phổ biến là “chain termination- kết thúc chuỗi” bằng việc sử dụng các deoxy nucleotide đã bị chỉnh sửa làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường. Nhóm 3’-OH đóng vai trị cho phép
①
gắn thêm một nucleotide mới vào chuỗi. Khi một ddNTP được thêm vào chuỗi, vì khơng có nhóm 3’-OH nên một nucleotide không được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại. Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn các dNTP vào mạch đơn của DNA để kéo dài mạch ở vị trí 3’- OH và dừng lại nếu gắn các ddNTP vào chuỗi.
Trong một phản ứng chứa cả dNTP và ddNTP nên sau phản ứng tổng hợp, hình thành các đoạn DNA có độ dài khác nhau do ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng. Dựa vào sự sai khác về độ dài các đoạn DNA hiển thị trên bản gel sau điện di để xác định trình tự trong gene. Kỹ thuật giải trình tự DNA tự động (Dye temination sequencing) sử dụng các ddNTP có đánh dấu huỳnh quang đã giúp cho việc sắp xếp trình tự DNA trở nên nhanh chóng và hiệu quả hơn. Mỗi loại ddNTP được gắn một màu có bước sóng phát xạ huỳnh quang khác nhau cho phép thực hiện giải trình tự trong một phản ứng duy nhất. Hệ thống điện di mao quản được sử dụng để đọc trình tự DNA một cách tự động. Cấu tạo của máy gồm 16 mao quản chứa gel polyacrylamide cho phép phân tích nhiều mẫu trong một lần điện di. Hệ thống detector gồm các camera có chùm tia laser đi qua nó để ghi nhận tín hiệu huỳnh quang một cách chính xác.
Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt q trình điện di, khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng và được camera ghi nhận và lưu lại thành một cường độ đỉnh sáng (peak) trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với nhau và phân tích thành trình tự của đoạn DNA [4].
Hình 2.2. Hình ảnh mơ tả q trình giải trình tự thế hệ mới theo nguyên lý Sanger sử dụng các ddNTP có đánh dấu huỳnh quang