Để tách dòng và xác định trình tự đoạn gen nhận được sau phản ứng PCR, sản phẩm PCR đã tinh sạch được gắn vào vector pTZ57R/T dưới sự xúc tác của T4-ligase. Hỗn hợp được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10b bằng phương pháp shock nhiệt để tạo plsamid tái tổ hợp.
Sau quá trình biến nạp, các tế bào vi khuẩn E. coli chứa vector tái tổ hợp được nuôi phục hồi và dịch tế bào được nuôi trên đĩa petri môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin ở 370C qua đêm để chọn lọc. Trong môi trường chọn lọc này theo lý thuyết các tế bào mang vector sẽ sống được trên môi trường chứa kháng sinh, các tế bào không mang vector sẽ chết.
Một khuẩn lạc màu xanh và một vài dòng khuẩn lạc màu trắng xuất hiện được lựa chọn một cách ngẫu nhiên và nuôi vào trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin (nồng độ 100µl/ml), lắc qua đêm ở nhiệt độ 370C, 200 vòng/phút. Sau đó tiến hành tách plasmid tái tổ hợp, tinh sạch và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả được thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Hình ảnh điện di plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc sau biến nạp
1-2: plasmid các dòng khuẩn lạc trắng đĩa biến nạp chủng VTCC-B-657; 3-4: plasmid các dòng khuẩn lạc trắng đĩa biến nạp chủng QN1;
đc: đối chứng (plasmid tách từ dòng khuẩn lạc xanh).
Kết quả hình 3.3 cho thấy dịch plasmid ở giếng 1 và 3 có thể mang phân đoạn chèn nên có kích thước lớn hơn so với đối chứng. Plasmid ở giếng 2 và 4 không có đoạn chèn có kích thước tương đương với đối chứng. Plasmid ở giếng 1 và 3 đã được cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn HindIII và XbaI. Kết quả điện di sản phẩm cắt cho thấy xuất hai băng DNA. Một băng có kích thước khoảng gần 3000 bp tương ứng với vector pTZ57R/T, một băng có kích thước dưới 500 bp tương ứng với kích thước gen azurin (hình 3.4). Như vậy, plasmid tái tổ hợp này có thể
mang phân đoạn gen azurin chèn vào. Plasmid tái tổ hợp đã được tinh sạch và gửi đọc trình tự nucleotide.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt
1: sản phẩm cắt bằng HindIII và XbaI dòng plasmid tái tổ hợp mang gen azurin của chủng VTCC-B-657; 2: sản phẩm cắt bằng HindIII và XbaI dòng plasmid tái
tổ hợp mang gen azurin của chủng QN1; M: marker 1kb.