.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Quy trình xử lý mẫu
* Chuẩn bị mẫu sơ bộ: Mỗi mẫu lấy tối thiểu 1 kg, xay nghiền nhỏ bằng máy nghiền mẫu.
* Tạo mẫu trắng: Sử dụng mẫu thịt lợn, khơng tẩm ướp gia vị và nướng chín bằng
lị vi sóng; để nguội và xay nghiền nhỏ, bảo quản ở -3oC, sử dụng trong 3 tháng. Phân tích lặp lại 10 lần, xác định mẫu trắng khơng cho tín hiệu tại thời gian lưu của chất phân tích.
* Quy trình chiết:
• Cân chính xác khoảng 5 g mẫu vào ống ly tâm 50 mL
ã Thờm 50 àL dung dch ni chun 10 µg/mL và để yên trong khoảng 15 phút
• Thêm vào mẫu 10 mL acetonitril : nước (1:1), lắc trong 1 phút
• Thêm 5,5 g NH4Cl, lắc đều trong 1 phút, lắc ngang hoặc siêu âm trong 30 phút.
• Ly tâm ở 6000 vịng/phút trong 5 phút.
• Hút 2 mL pha hữu cơ phía trên sang ống ly tâm 15 mL có chứa hỗn hợp muối gồm 300 mg MgSO4 + 100 mg C18và 2 mL n-hexan bão hịa ACN.
• Lắc và ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút. Dùng pipet pasteur loại bỏ lớp n-hexan.
• Hút 0,5 mL lớp ACN vào vial, thêm 0,5 mL DCM, lắc đều.
• Phân tích trên GC-MS/MS.
2.4.2. Phương pháp phân tích bằng GC-MS/MS
Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng phương pháp phân tích bằng GC- MS/MS, khảo sát các điều kiện gồm:
• Điều kiện GC: Khảo sát điều kiện tách các nitrosamin qua cột sắc ký DB1701 (30m x 0,25mm x 0,25µm) và cột DB5MS.
• Điều kiện MS: Mỗi chất phân tích lựa chọn 1 ion mẹ và 2 ion con ở chế độ EI 70eV. Một ion con dùng để định lượng, ion con còn lại dùng để khẳng định.
2.4.3. Phương pháp thẩm định
2.4.3.1. Tính chọn lọc
Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua so sánh phổ của các chất phân tích trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Mẫu trắng khơng được lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn.
Ngồi ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng (IP) yêu cầu có tối thiểu 4 điểm IP và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC657/20002 của Châu Âu.
2.4.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
LOD, LOQ được xác định dựa vào tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp cịn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio).
LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3). LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10).
2.4.3.3. Khoảng làm việc và đường chuẩn
Để xác định khoảng làm việc chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi từ 0,5 đến 100 ng/mL (tương đương 0,5 đến 100 µg/kg trên nền mẫu) và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Sau đó vẽ đường cong phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi khơng cịn làm việc.
Sau khi xác định được khoảng làm việc của các chất, chúng tôi đã xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực (pha trên nền mẫu trắng), nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích. Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tỷ lệ tín hiệu chất ngoại chuẩn nồng độ ngoại chuẩn (trục hoành x).
2.4.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi
Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, chúng tơi tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau là 0,5; 10 và 100 µg/kg (n = 6) và tính tốn kết quả theo các cơng thức sau:
- Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối RSD(%).: 𝑅𝑆𝐷% =𝑆 𝑥̅× 100 Trong đó: 1 1 2 N x x S N i i
xi : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ “i” : Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm S: Độ lệch chuẩn N : Số lần thử nghiệm. - Độ thu hồi R(%) = C Cc .100 Trong đó: R: Độ thu hồi (%)
C : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn. Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết).
2.4.4. Phương pháp xử lý kết quả
Kết quả phân tích trên thiết bị được xử lý bằng phần mềm Mass Hunter của Agilent. Kết quả thẩm định phương pháp được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel.
2.4.5. Phương pháp lấy mẫu
- Lấy mẫu theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên. - Tổng số mẫu nghiên cứu: 30 mẫu thịt nướng.
- Địa điểm lấy mẫu: Các chợ và cửa hàng ở Hà Nội.