Bảng 3.4. Khoảng làm việc và độ chệch C (ng/g) C tính lại C (ng/g) C tính lại (ng/g) Bias (%) C tính lại (ng/g) Bias (%) C tính lại (ng/g) Bias (%) 0,5 0.54 8.00 0.56 12.00 0.46 -7.54 2 2.08 4.00 1.96 -2.00 2.26 12.89 5 5.09 1.80 4.75 -5.00 4.57 -8.68 10 10.24 2.40 10.35 3.50 10.16 1.64 20 19.44 -2.80 19.78 -1.10 19.14 -4.32 50 50.93 1.86 50.04 0.08 48.23 -3.54 100 100.96 0.96 107.84 7.84 101.04 1.04
NDMA NDPA NDPhA
Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ này tín hiệu của các nitrosamin tỷ lệ làm việc với nồng độ với R2> 0,99 với độ chệch <15% với tất cả các giá trị.
3.2.4. Độ lặp lại và độ thu hồi
Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các mức nồng độ khác nhau 0,5; 10; 100 ng/g, phân tích lặp lại 6 lần cho mỗi nồng độ.
Các kết quả tính độ lệch chuẩn tương đối và độ thu hồi được trình bày trong bảng 3.5, 3.6, 3.7.
Bảng 3.5. Độ lặp lại và độ thu hồi của NDMA
STT Spic
nội chuẩn Spic C (ng/g) R%
Trung bình SD RSD % spk0.5-01.D 73062 1347 0,54 108,0 0,48 0,06 11,8 spk0.5-02.D 64833 1117 0,42 84,0 spk0.5-03.D 71344 1133 0,48 95,0 spk0.5-04.D 66915 1000 0,42 83,0 spk0.5-05.D 79506 1365 0,55 109,0 spk0.5-06.D 64577 1223 0,47 93,0 spk10-01.D 100905 18137 10,51 105,1 9,96 0,56 5,6
spk10-02.D 64931 1043 10,61 106,1 spk10-03.D 71684 13464 9,54 95,4 spk10-04.D 108601 18980 9,67 96,7 spk10-05.D 67466 12509 9,23 92,3 spk10-06.D 78291 14373 10,21 102,1 spk100-01.D 69305 133670 10,21 102,1 101,63 5,58 5,5 spk100-02.D 66521 130171 98,25 98,3 spk100-03.D 80306 151751 106,47 106,5 spk100-04.D 76987 148611 105,87 105,9 spk100-05.D 79163 152744 95,21 95,2 spk100-06.D 95258 184093 96,45 96,5
Bảng 3.6. Độ lặp lại và độ thu hồi của NDPA
STT Spic
nội chuẩn Spic C (ng/g) R%
Trung bình SD RSD % spk0.5-01.D 73062 419 0,54 108,0 0,43 0,07 15,7 spk0.5-02.D 64833 567 0,50 100,0 spk0.5-03.D 71344 405 0,37 74,0 spk0.5-04.D 66915 532 0,40 80,0 spk0.5-05.D 79506 524 0,39 78,0 spk0.5-06.D 64577 515 0,39 78,0 spk10-01.D 100905 8539 8,46 84,6 9,25 0,92 9,9 spk10-02.D 64931 5992 9,23 92,3 spk10-03.D 71684 7803 10,89 108,9 spk10-04.D 108601 9204 8,48 84,8 spk10-05.D 67466 5957 8,83 88,3 spk10-06.D 78291 7509 9,59 95,9 spk100-01.D 69305 74536 107,55 107,5 89,3 12,4 13,9 spk100-02.D 66521 66304 99,67 99,7 spk100-03.D 80306 60216 74,98 75,0 spk100-04.D 76987 68333 88,76 88,8 spk100-05.D 79163 68005 85,91 85,9 spk100-06.D 95258 75160 78,90 78,9
Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi của NDPhA
STT Spic
nội chuẩn Spic C (ng/g) R%
Trung bình SD RSD % spk0.5-01.D 73062 6115 0,36 72,0 0,45 0,05 11,6 spk0.5-02.D 64833 7168 0,42 84,0 spk0.5-03.D 71344 7187 0,47 94,0 spk0.5-04.D 66915 7467 0,44 88,0 spk0.5-05.D 79506 7250 0,50 100,0 spk0.5-06.D 64577 8077 0,49 98,0 spk10-01.D 100905 75996 10,44 104,4 10,36 0,68 6,6 spk10-02.D 64931 70633 9,78 97,8 spk10-03.D 71684 104536 10,85 108,5 spk10-04.D 108601 68918 9,29 92,9 spk10-05.D 67466 70996 10,75 107,5 spk10-06.D 78291 109076 11,02 110,2 spk100-01.D 69305 826899 104,05 104,1 89,23 8,33 9,3 spk100-02.D 66521 704429 92,47 92,5 spk100-03.D 80306 679099 87,68 87,7 spk100-04.D 76987 693914 87,31 87,3 spk100-05.D 79163 605320 83,45 83,5 spk100-06.D 95258 627087 80,45 80,5
Nhận xét: Các kết quả trên cho thấy các giá trị độ thu hồi trung bình là
91,3% và độ lệch chuẩn tương đối từ 5,5 – 15,7%. Điều này cho thấy phương pháp có độ chính xác đáp ứng u cầu của AOAC.
3.2.5. Độ lặp lại khác ngày
Thực hiện phân tích cùng một mẫu trắng, thêm chuẩn ở mức 10 ng/g vào hai ngày khác nhau. Tính độ lặp lại khác ngày theo phương pháp trung bình bình phương độ lệch chuẩn. Kết quả tính tốn được trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Độ lặp lại khác ngày của các nitrosamin nghiên cứu
Ngày
thực hiện STT
NDMA NDPA NDPhA
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 1 Ngày 2
C (ng/g) 1 10,51 10,40 8,46 9,88 10,44 9,34 2 10,61 10,07 9,23 9,97 9,78 10,87 3 9,54 9,35 10,89 10,54 10,85 10,92 4 9,67 10,57 8,48 10,20 9,29 10,34 5 9,23 10,61 8,83 9,34 10,75 9,24 6 10,21 9,09 9,59 9,60 11,02 9,68 Trung bình 9,99 9,58 10,21 SDr 0,62 0,53 0,74 RSDr 6,2 5,5 7,3
Phương pháp có độ tái lặp khác ngày từ 5,3 – 7,3% với các nitrosamin nghiên cứu, đáp ứng được yêu cầu RSDr ≤ 22% theo AOAC.
3.3. Ứng dụng phương pháp để sơ bộ xác định hàm lượng nitrosamin trong
thịt nướng lấy ở địa bàn Hà Nội
3.3.1. Kết quả xác định hàm lượng nitrosamin trong mẫu thực tế
Trên cơ sở phương pháp đã xây dựng, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng nitrosamin trong 30 mẫu thịt nướng được lấy tại Hà Nội năm 2017. Các mẫu được mã hóa, bảo quản ở nhiệt độ -3oC – -8oC. Mẫu được phân tích trong thời gian tối đa 1 tháng sau khi lấy. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả phân tích mẫu thực tế
TT Đối tượng mẫu Số lượng Số mẫu phát hiện
NDMA NDPA NDPhA
1. Thịt lợn nướng 10 2 0 8
2. Thịt gia cầm nướng 10 0 0 5
Nhận xét: Qua khảo sát sơ bộ cho thấy, khả năng nhiễm độc tố nhóm nitrosamin trong các sản phẩm này là khá cao, tuy nhiên mức hàm lượng tương đối thấp. Có 2 mẫu thịt lợn và 2 mẫu thịt bị có nhiễm NDMA (4 mẫu tương đương 13% số mẫu) với mức hàm lượng từ 0,52 – 0,69 ng/g. Các mẫu nhiễm NDPhA chiếm số lượng khá lớn (17 mẫu tương đương 57% số mẫu); với mức hàm lượng từ 0,50 – 1,2 ng/g.
3.3.2. So sánh các cách chế biến khác nhau ảnh hưởng đến lượng nitrosamin tạo thành thành
Qua khảo sát một số cách chế biến thông thường hiện nay - sử dụng cùng một mẫu xúc xích có chứa nitrat - như: rán, nướng than, nướng vi sóng (với thời gian chế biến như nhau); nhận thấy khi chế biến bằng nướng than mẫu nhiễm NDMA với hàm lượng cao nhất (~ 3 ng/g), thấp hơn là rán (~ 2 ng/g) và thấp nhất là nướng vi sóng (~ 1 ng/g). Các mẫu đều khơng nhiễm NDPA và NDPhA. Kết quả thể hiện trong bảng 3.10.
Bảng 3.10. So sánh các cách chế biến khác nhau
Cách chế biến Tên mẫu Nồng độ (ng/g)
Rán XX-ran-01.D 2,29 XX-ran-02.D 2,20 XX-ran-03.D 2,13 XX-ran-04.D 2,36 Nướng vi sóng (nướng điện) XX-nuongdien-01.D 1,14 XX-nuongdien-02.D 1,14 XX-nuongdien-03.D 1,17 XX-nuongdien-04.D 0,98 Nướng than Xx-nuongthan-01.D 2,89 Xx-nuongthan-02.D 3,04 Xx-nuongthan-03.D 3,01 Xx-nuongthan-04.D 3,01
4. KẾT LUẬN
Sau quá trình thực hiện đề tài, một số kết quả thu được như sau:
1. Tối ưu hóa được các điều kiện phân tích và xây dựng thành cơng quy trình phân tích đồng thời ba nitrosamin trong các sản phẩm thịt bằng sắc ký khí khối phổ hai lần.
2. Phương pháp đã được thẩm định và các thông số đạt yêu cầu của AOAC. 3. Phương pháp được áp dụng để phân tích 30 mẫu thịt (nướng, quay, rán). Kết
quả phân tích cho thấy 19/30 mẫu có kết quả dương tính với hàm lượng tương đối thấp (0,5 – 1,2 ng/g).
4. So sánh 3 cách chế biến thơng thường: nướng than, nướng vi sóng, rán cho thấy nướng than có hàm lượng cao nhất, thấp hơn là rán và thấp nhất là nướng vi sóng.
5. TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
[1]TCVN 10069:2013, “Đồ dùng trẻ em – phương pháp xác định sự giải phóng nitrosamin và các chất có khả năng chuyển hóa thành N-nitrosamin từ núm ty và ty giả làm bằng elastome hoặc cao su”.
[2]TCVN 11602:2016, “Thịt và sản phẩm thịt – xác định hàm lượng N-nitrosamin – phương pháp sắc ký khí sử dụng thiết bị năng lượng nhiệt”.
Tiếng Anh
[3]A. R. Tricker and R. Preussmann (1991), “Carcinogenic N-nitrosamines in the diet: occurrence, formation, mechanisms and carcinogenic potential”,Mutation
Research/Genetic Toxicology, vol. 259, no. 3–4, pp. 277–289.
[4]A. Sannino and L. Bolzoni (2013), “GC/CI–MS/MS method for the identification and quantification of volatile N-nitrosamines in meat products”,Food chemistry, vol. 141, no. 4, pp. 3925–3930.
[5]AOAC International (1984), “AOAC 982.22 - N-Nitrosamines (Volatile in Fried Bacon) - Mineral Oil Vacuum Distillation - Thermal Energy Analyser (TEA) Method. Final Action 1984”, AOAC Official Method.
[6]AOAC International (1988), “AOAC 982.11 - N-Nitrosodimethylamine in Beer - Gas Chromatographic Method. Final Action 1988”, AOAC Official Method. [7]C. Crews (2010), “The determination of N-nitrosamines in food”,Quality Assurance
and Safety of Crops & Foods, vol. 2, no. 1, pp. 2–12.
[8]D. Kocak, M. Z. Ozel, F. Gogus, J. F. Hamilton, and A. C. Lewis (2012), “Determination of volatile nitrosamines in grilled lamb and vegetables using comprehensive gas chromatography–Nitrogen chemiluminescence detection”,Food chemistry, vol. 135, no. 4, pp. 2215–2220.
[9]D. M. Pérez, G. G. Alatorre, E. B. Álvarez, E. E. Silva, and J. F. J. Alvarado (2008), “Solid-phase microextraction of N-nitrosodimethylamine in beer”,Food
Chemistry, vol. 107, no. 3, pp. 1348–1352.
[10]EPA (2005), “EPA Method 521: Determination of nitrosamines in drinking water by solid phase extraction and capillary column gas chromatography with large
volume injection and chemical ionization tandem mass spectrometry (MS/MS)”, Environmental Protection Agency.
[11]J. A. McDonald, N. B. Harden, L. D. Nghiem, and S. J. Khan (2012), “Analysis of N-nitrosamines in water by isotope dilution gas chromatography–electron ionisation tandem mass spectrometry”,Talanta, vol. 99, pp. 146–154.
[12]J. EGrebel and I. M. Suffet (2007), “Nitrogen–phosphorus detection and nitrogen chemiluminescence detection of volatile nitrosamines in water matrices: optimization and performance comparison”,Journal of Chromatography A, vol. 1175, no. 1, pp. 141–144.
[13]J. W. Pensabene, W. Fiddler, R. J. Maxwell, A. R. Lightfield, and J. W. Hampson (1995), “Supercritical fluid extraction of N-nitrosamines in hams processed in elastic rubber nettings”,Journal of AOAC International, vol. 78, no. 3, pp. 744– 748.
[14]J.-P. Alseem (1979), “The organic chemistry of N-nitrosamines: A brief review”, ACS Publications.
[15]M. Al-Kaseem, Z. Al-Assaf, and F. Karabet (2013), “Rapid and Simple Extraction Method for Volatile N-nitrosamines in meat products”,Pharmacology &
Pharmacy, vol. 4, no. 08, p. 611.
[16]M. Krauss and J. Hollender (2008), “Analysis of nitrosamines in wastewater: exploring the trace level quantification capabilities of a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer”,Analytical Chemistry, vol. 80, no. 3, pp. 834– 842.
[17]M. Z. Ozel, F. Gogus, S. Yagci, J. F. Hamilton, and A. C. Lewis (2010), “Determination of volatile nitrosamines in various meat products using comprehensive gas chromatography–nitrogen chemiluminescence detection”,Food and Chemical Toxicology, vol. 48, no. 11, pp. 3268–3273.
[18]M.-C. Huang, H.-C. Chen, S.-C. Fu, and W.-H. Ding (2013), “Determination of volatile N-nitrosamines in meat products by microwave-assisted extraction coupled with dispersive micro solid-phase extraction and gas chromatography–
Chemical ionisation mass spectrometry”,Food chemistry, vol. 138, no. 1, pp. 227–233.
[19]N. Campillo, P. Viđas, N. Martínez-Castillo, and M. Hernández-Córdoba (2011), “Determination of volatile nitrosamines in meat products by microwave-assisted extraction and dispersive liquid–liquid microextraction coupled to gas chromatography–mass spectrometry”,Journal of Chromatography A, vol. 1218, no. 14, pp. 1815–1821.
[20]N. P. Sen and S. Seaman (1981), “Volatile N-nitrosamines in dried foods”,Journal-Association of Official Analytical Chemists, vol. 64, no. 5, pp. 1238–1242.
[21]P. Jakszyn and C. A. González (2006), “Nitrosamine and related food intake and gastric and oesophageal cancer risk: a systematic review of the epidemiological evidence”,World journal of gastroenterology: WJG, vol. 12, no. 27, p. 4296. [22]R. A. Scanlan (1983), “Formation and occurrence of nitrosamines in food”,Cancer
Research, vol. 43, no. 5 Suppl, p. 2435s–2440s.
[23]R. Andrade, F. G. Reyes, and S. Rath (2005), “A method for the determination of volatile N-nitrosamines in food by HS-SPME-GC-TEA”,Food Chemistry, vol. 91, no. 1, pp. 173–179.
[24]S. Eerola, I. Otegui, L. Saari, and A. Rizzo (1998), “Application of liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry and tandem mass spectrometry to the determination of volatile nitrosamines in dry sausages”,Food Additives & Contaminants, vol. 15, no. 3, pp. 270–279. [25]S. J. Lehotay, Y. Sapozhnikova, L. Han, and J. J. Johnston (2015), “Analysis of
nitrosamines in cooked bacon by QuEChERS sample preparation and gas chromatography–tandem mass spectrometry with backflushing”,Journal of
agricultural and food chemistry, vol. 63, no. 47, pp. 10341–10351.
[26]S. Raoul, E. Gremaud, H. Biaudet, and R. J. Turesky (1997), “Rapid solid-phase extraction method for the detection of volatile nitrosamines in food”,Journal of
[27]S. S. Herrmann, L. Duedahl-Olesen, and K. Granby (2014), “Simultaneous determination of volatile and non-volatile nitrosamines in processed meat products by liquid chromatography tandem mass spectrometry using atmospheric pressure chemical ionisation and electrospray ionisation”,Journal of Chromatography a, vol. 1330, pp. 20–29.
[28]S. W. Krasner, W. A. Mitch, D. L. McCurry, D. Hanigan, and P. Westerhoff(2013), “Formation, precursors, control, and occurrence of nitrosamines in drinking water: a review”,Water research, vol. 47, no. 13, pp. 4433–4450.
[29]S. Yurchenko and U. Mölder(2006), “Volatile N-nitrosamines in various fish products”,Food chemistry, vol. 96, no. 2, pp. 325–333.
[30]S. Yurchenko and U. Mölder(2007), “The occurrence of volatile N-nitrosamines in Estonian meat products”,Food Chemistry, vol. 100, no. 4, pp. 1713–1721.
[31]W. Fiddler and J. W. Pensabene(1996), “Supercritical fluid extraction of volatile N-nitrosamines in fried bacon and its drippings: method comparison”,Journal of
AOAC International, vol. 79, no. 4, pp. 895–901.
[32]X. Zeng, W. Bai, Y. Xian, H. Dong, and D. Luo(2016), “Application of QuEChERS-based purification coupled with isotope dilution gas chromatography-mass spectrometry method for the determination of N- nitrosamines in soy sauce”,Analytical Methods, vol. 8, no. 26, pp. 5248–5254. [33]Y. Qiu, J.-H. Chen, W. Yu, P. Wang, M. Rong, and H. Deng(2017),
“Contamination of Chinese salted fish with volatile N-nitrosamines as determined by QuEChERS and gas chromatography–tandem mass spectrometry”,Food Chemistry, vol. 232, pp. 763–769.
[34]Z. Zhao, Y. Xu, X. Liu, X. Shi, and Y. Lu(2017), “Rapid determination of 10 volatile N-nitrosamines in sour meats by modified QuEChERS and gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry”,Se pu = Chinese journal
PHỤ LỤC I
VIỆN KIỂM NGHIỆM AN TOÀN VỆ SINH THỰC PHẨM QUỐC GIA QUY TRÌNH THAO TÁC CHUẨN
XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ NITROSAMIN TRONG CÁC SẢN PHẨM THỊT BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ HAI LẦN GS-MS/MS
Mã số: H.HD.QT.476
Lần ban hành: 01
Ngày ban hành:
Ngày hiệu lực:
Người biên soạn Người thẩm xét Người phê duyệt
Họ Tên Bùi Cao Tiến Trần Cao Sơn Lê Thị Hồng Hảo
Ký tên Ngày
Theo dõi soát xét, sửa đổi
Lần Mục Nội dung sửa đổi Ngày sửa đổi
1. Nguyên lý
Nitrosamin trong mẫu được chiết bằng kỹ thuật QuEChERS sử dụng muối NH4Cl, làm sạch và loại béo bằng n-hexan và C18, sau đó phân tích trên GC-MS/MS.
2. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này áp đụng để xác định hàm lượng nitrosamin trong mẫu thịt và các sản phẩm thịt.
3. Tài liệu viện dẫn
-S. J. Lehotay, Y. Sapozhnikova, L. Han, and J. J. Johnston (2015), “Analysis of nitrosamines in cooked bacon by QuEChERS sample preparation and gas
chromatography–tandem mass spectrometry with backflushing”, Journal of agricultural and food chemistry, vol. 63, no. 47, pp. 10341–10351.
-Z. Zhao, Y. Xu, X. Liu, X. Shi, and Y. Lu (2017), “Rapid determination of 10 volatile N-nitrosamines in sour meats by modified QuEChERS and gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry”, Se pu = Chinese journal of chromatography, vol. 35, no. 10, pp. 1086–1093.
4. Định nghĩa
Không
5. Thiết bị, dụng cụ
5.1. Thiết bị
5.1.1. Máy sắc ký khí khối phổ hai lần GC-MS/MS (kiểu ba tứ cực). 5.1.2. Cột sắc ký DB-1701.
5.1.3. Bể rung siêu âm.
5.1.4. Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,1 mg. 5.1.5. Máy đồng nhất mẫu.
5.1.6. Máy lắc vortex.
5.1.7. Máy ly tâm có thể đạt 6000 rpm và 13000 rpm trên phút. 5.1.8. Máy
5.2. Dụng cụ
5.2.1. Micropipet 10 – 100 μL, 100-1000 μL, 500 – 5000 μL và đầu côn tương ứng 5.2.2. Ống ly tâm 50 mL
5.2.3. Vial 1,8 mL
5.2.4. Bình định mức các loại
6. Hóa chất, thuốc thử
Tất cả các hóa chất đều là loại tinh khiết phân tích.
6.1. Chuẩn mix nitrosamin (NDMA, NDPA, NDPhA) 2000 µg/mL trong methanol (Dr. Ehrenstorfer).Nội chuẩn NDMA-d6 (Dr. Ehrenstorfer).
6.2. Nội chuẩn NDMA-d6 (Dr. Ehrenstorfer).
6.3. BSTFA (N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide) (Sigma hoặc tương đương). 6.4. Acetonitril (Merck)
6.5. Dichloromethan (Merck) 6.6. PSA (Agilent) 6.7. C18 (Agilent) 6.8. Hexan (Merck) 6.9. NH4Cl (Merck) 6.10. MgSO4 (Merck) 7. Các bước tiến hành
7.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Dùng pipet (5.2.1) hút chính xác 100 µL dung dịch chuẩn gốc (6.1) vào bình định mức (5.2.4) 20 mL, định mức bằng ACN (6.4), thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/mL. Bảo quản ở nhiệt độ -18oC, sử dụng trong 6 tháng.
Dùng pipet hút chính xác 100 µL dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/mL vào vial (5.2.3), thêm 900 µL ACN, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 µg/mL. Pha mới khi sử dụng.
7.2. Chuẩn bị dung dịch nội chuẩn
7.2.1. Dung dịch nội chuẩn gốc
Cân chính xác 10 mg nội chuẩn NDMA-d6 (6.2) trên cân phân tích (5.1.4) vào bình định mức 100 mL (5.2.4), định mức bằng ACN (6.4) thu được dung dịch nội chuẩn gốc có nồng độ 100 µg/mL. Bảo quản ở -18oC, sử dụng trong 1 năm.
Chú ý: Nồng độ dung dịch nội chuẩn được tính tốn theo khối lượng cân thực tế
7.2.2. Dung dịch nội chuẩn trung gian
Dùng pipet (5.2.1) hút chính xác 1 mL dung dịch nội chuẩn gốc (7.2.1) vào bình định mức (5.2.4) 10 mL, định mức bằng ACN (6.4), thu được dung dịch nội chuẩn trung gian 10 µg/mL. Bảo quản ở nhiệt độ -18oC, sử dụng trong 6 tháng
7.3. Chuẩn bị mẫu
7.3.1. Chuẩn bị mẫu sơ bộ
Mẫu thịt được đồng nhất bằng máy đồng nhất mẫu, tối thiểu 1 kg. 7.3.2. Mẫu thử
• Cân chính xác khoảng 5 g mẫu vào ống ly tâm 50 mL
• Thêm vào mẫu 10 mL acetonitril : nước (1:1), lắc trong 1 phút
• Thêm 5,5 g NH4Cl, lắc đều trong 1 phút, siêu âm trong 30 phút
• Ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút.
• Hút 2 mL pha hữu cơ phía trên sang ống ly tâm 15 mL có chứa hỗn hợp muối gồm 300 mg MgSO4 + 100 mg C18 và 2 mL n-hexan bão hịa ACN.
• Lắc và ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút. Dùng pipet pasteur loại bỏ lớp n- hexan.
• Hút 0,5 mL lớp ACN vào vial, thêm 0,5 mL DCM, lắc đều
• Phân tích trên GC-MS/MS