1.3.3. Các thông số đánh giá trong phương pháp điện di mao quản
Diện tích pic và độ phân giải là hai yếu tố được xem xét để định lượng trong CE. Diện tích pic tỉ lệ với nồng độ chất phân tích đi qua detector. Dựa vào giá trị diện tích pic, ta có thể xác định được nồng độ của chất phân tích có trong mẫu.
S = k.C (3)
Trong đó: S là diện tích pic thu được (V.s) k là hệ số tỉ lệ (V.s.mL/mg)
C là nồng độ chất phân tích (mg/mL)
Việc xác định diện tích pic được thực hiện đơn giản nhờ các phần mềm ghi dữ liệu và tín hiệu từ detector.
Độ phân giải được xác định bằng công thức sau:
Rij = 2(ti−tj)
Trong đó: ti và tj là thời gian di chuyển của hai chất i và j (ti > tj ) (s) wi và wj là độ rộng đáy của hai pic chất i và j
Theo lí thuyết, hai pic được coi là tách hồn tồn khỏi nhau (với độ tin cậy 95%) khi độ phân giải R ≥ 1,5.
1.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tách chất trong điện di mao quản Dung dịch điện di nền
Dung dịch điện di nền (BGE) có vai trị quyết định trong q trình tách chất. Như đã thấy trong cơng thức (1), chất điện di nền ảnh hưởng tới tốc độ di chuyển của các ion, thông qua giá trị độ nhớt của dung dịch và khả năng solvat hóa (thể hiện qua bán kính hiđrat r).
BGE thường được sử dụng là các dung dịch đệm trong môi trường nước. Thành phần của hệ đệm bao gồm một hợp phần mang tính axit, hợp phần cịn lại mang tính bazơ. Các yếu tố cần quan tâm khi lựa chọn dung dịch điện di nền phù hợp bao gồm thành phần, nồng độ các hợp phần và pH dung dịch.
Điện thế tách
Điện trường được tạo ra khi áp vào hai đầu mao quản một hiệu điện thế lớn, cỡ kV, theo công thức E = V/L. Đây là động lực cho quá trình di chuyển của các ion, ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng tách chất và tín hiệu thu được. Khi hiệu điện thế nhỏ, chân pic dãn và diện tích pic lớn hơn, tuy nhiên thời gian phân tích dài hơn. Trong khi đó, hiệu điện thế lớn có thời gian phân tích ngắn nhưng diện tích pic thu hẹp lại, đồng thời cịn gây ra hiệu ứng nhiệt. Do đó, giá trị độ lớn của hiệu điện thế đặt vào là yếu tố quan trọng cần quan tâm.
Lượng mẫu đi vào mao quản
Lượng mẫu đi vào mao quản ảnh hưởng lớn tới diện tích và khả năng phân tách các pic. Lượng mẫu ít dẫn tới diện tích pic giảm, làm giảm khả năng phát hiện chất, trong khi lượng mẫu lớn, diện tích pic tăng, làm giảm độ phân giải. Đối với một
hệ điện di mao quản đơn giản, vận hành bằng tay, sử dụng phương pháp bơm mẫu xi phơng thì lượng mẫu đi vào mao quản phụ thuộc chủ yếu vào thời gian bơm mẫu. Mặc dù vậy, với phân tích đơn đối tượng, thời gian bơm mẫu thường được giữ cố định.
Ngồi ra, cịn một số yếu tố khác trên hệ CE ảnh hưởng tới q trình tách chất như chiều dài và đường kính trong của mao quản. Tuy nhiên, thông thường, các yếu tố này được giữ cố định trên mỗi hệ thiết bị.
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM
2.1 Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu của đề tài là xây dựng phương pháp điện di mao quản để phân tích xác định hàm lượng 10-HDA trong sữa ong chúa. Thực nghiệm bao gồm: khảo sát lựa chọn dung mơi chiết thích hợp và vận dụng phương pháp đã xây dựng được tiến hành xác định hàm lượng 10-HDA trong các mẫu thực tế được thu mua ngoài hiện trường. Trên cơ sở kết quả nghiên cứu cụ thể, tiến hành so sánh, đánh giá với phương pháp tiêu chuẩn HPLC.
Phương pháp nghiên cứu
Việc nghiên cứu khảo sát một số điều kiện tách 10-HDA được thực hiện trên hệ thiết bị CE-C4D với cột mao quản có tổng chiều dài 60 cm, đường kính trong 50 µm. Mẫu được bơm vào mao quản bằng phương pháp thủy động lực học theo kiểu xi phông bằng cách nâng một đầu mao quản (đặt trong dung dịch mẫu) lên ở độ cao 10 cm so với đầu mao quản còn lại. Độ cao này được cố định trong tất cả các thí nghiệm. Dung dịch chuẩn của 10-HDA ở nồng độ 20 mg/L được sử dụng để khảo sát các điều kiện phân tích. Trong các thí nghiệm, điện thế tách được giữ cố định ở giá trị -15 kV và thời gian bơm mẫu 30 s; trừ các thí nghiệm khảo sát điều kiện điện thế và thời gian bơm. Điều kiện phân tích được lựa chọn trên cho cơ sở đường nền ổn định, tín hiệu của các chất phân tích có diện tích lớn, hình dạng sắc nét.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát điều kiện phân tích trên CE Khảo sát thành phần dung dịch điện li nền Khảo sát thành phần dung dịch điện li nền
Qua tham khảo tài liệu, một số loại dung dịch điện li nền có giá trị pH thấp (pH< 2) là các axit hữu cơ với các nồng độ khác nhau được lựa chọn để nghiên cứu quy trình phân tách 10-HDA, bao gồm axit axetic, axit lactic, hydroxymetyl aminometan (Tris), axit 2-(N-morpholino) etanesulfonic (MES), axít 2-(N- morpholino) etanesulfonic (MOPS), axít N-Cyclohexyl-2-aminoetanesulfonic
(CHES) với cùng một nồng độ là 100 mM và pH = 9. Sau khi lựa chọn được thành phần dung dịch điện ly nền thích hợp, tiếp tục nghiên cứu sự thay đổi nồng độ và pH với các giá trị khảo sát pH = 8 ÷ 9 và nồng độ là 20 mM, 50 mM và 100 mM.
Khảo sát và tối ưu thời gian bơm mẫu
Ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu đến diện tích và hình dạng tín hiệu của chất phân tích được khảo sát với thời gian bơm mẫu thay đổi từ 10 s tới 60 s.
Khảo sát và tối ưu điện thế tách
Điện thế đặt vào hai đầu mao quản tạo ra một điện trường, là động lực cho quá trình di chuyển của các ion, ảnh hưởng tới quá trình tách chất. Trong khảo sát này, điện thế tách thay đổi từ 10 ÷ 20 kV.
2.2.2 Khảo sát quy trình xử lí mẫu
Mẫu trước khi bơm vào thiết bị CE để tách và nhận biết cần phải hòa tan trong dung mơi thích hợp và lọc. Việc khảo sát quy trình xử lý mẫu được thực hiện như sau:
Khảo sát giấy lọc và quy trình ly tâm mẫu
Ba loại giấy lọc được lựa chọn trong nghiên cứu này là: giấy lọc xenluloso axetat, giấy lọc nilon và giấy lọc PTFE đều có cỡ lỗ 0,2 µm. Mẫu được hịa tan trong 50 mL nước deion, sau đó được chia làm 2 phần. Phần 1 được đem đi ly tâm 1500 rpm trong 15 phút và lọc với từng loại giấy lọc đã nêu trên. Phần 2 không ly tâm mà được đem lọc trực tiếp trên từng loại giấy lọc. Dịch lọc được bơm trực tiếp vào thiết bị CE-C4D và so sánh diện tích tín hiệu 10-HDA thu được.
Khảo sát dung mơi hữu cơ và hệ dung mơi hịa tan
Bốn hệ dung mơi dùng để hịa tan mẫu được khảo sát là : nước deion, hỗn hộp của nước deion với metanol, etanol và isopropanol có tỷ lệ thể tích nước deion : dung mơi hữu cơ là 1:1. Thực nghiệm được tiến hành với ba loại mẫu: mẫu sữa ong chúa tươi, mẫu sữa ong chúa dạng gel và mẫu sữa ong chúa dạng bột. Cân lượng chính xác
gần 1 g mẫu, sau đó hịa tan vào 50 mL của bốn loại dung môi nêu trên, lắc, ly tâm 1500 rpm trong 15 phút, lọc qua giấy lọc nilon 0,2 µm. Sau đó dịch lọc được bơm lên thiết bị CE-C4D. Xác định diện tích tín hiệu 10-HDA và hiệu chỉnh lại theo số gam mẫu chính xác đã sử dụng để so sánh các giá trị diện tích tìm ra hệ dung mơi cho kết quả diện tích pic cao nhất.
Khảo sát tỉ lệ các thành phần của dung môi chiết
Sau khi chọn được dung mơi chiết thích hợp, tiến hành khảo sát và tối ưu tỉ lệ thể tích dung mơi : nước deion với giá trị thay đổi từ 10 : 90, 25 : 75, 30 : 70, 40 : 60, 50 : 50, 70 : 30 (v:v). Mẫu sử dụng trong thí nghiệm là mẫu sữa ong chúa dạng bột đồng nhất. Cân một lượng chính xác khoảng 1 g, rồi đem hòa tan với 50 mL của từng tỉ lệ dung mơi hịa tan đã nêu trên, lắc, ly tâm 1500 rpm trong 15 phút, và lọc qua giấy lọc nilon 0,2 µm. Sau đó, dịch lọc được đưa vào hệ thiết bị CE-C4D để phân tích. Diện tích tín hiệu 10-HDA thu được được hiệu chỉnh lại theo số gam mẫu chính xác đã sử dụng để so sánh các giá trị diện tích pic và tìm ra tỉ lệ dung mơi thich hợp chi kết quả diện tích pic cao nhất.
2.3. Đánh giá phương pháp
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện của thiết bị IDL: là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích cịn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền. Đối với các quá trình trong thiết bị điện di, IDL được tính bằng nồng độ chất phân tích trong dung mơi cho tín hiệu gấp 3 lần nhiễu nền.
Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) là giá trị nồng độ thấp nhất của một chất cần phân tích có độ chính xác đến 99% và nồng độ chất cần phân tích lớn hơn 0
Giới hạn định lượng của phương pháp (MQL): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của nền.
Độ chính xác
Độ chính xác của phương pháp được đánh giá qua hai thông số: độ chụm và độ đúng. Độ chụm được đánh giá thông qua giá trị độ lặp lại và độ tái lặp.
Độ lặp lại là chênh lệch giữa các giá trị riêng lẻ xi và giá trị trung bình được tiến hành trên các mẫu thử giống hệt nhau, bằng một phương pháp phân tích, và trong điều kiện thí nghiệm giống nhau ( cùng người phân tích, cùng trang thiết bị, phịng thí nghiệm, trong khoảng thời gian ngắn). Độ lặp lại có thể xác định thơng qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD %) của thời gian di chuyển và diện tích pic khi thực hiện 7 phép phân tích lặp lại đối với các dung dịch chuẩn có nồng độ 10-HDA là 20 mg/L.
Độ tái lặp được tính là sự thay đổi của kết quả đo trên cùng một mẫu thử trong khoảng thời gian dài liên tiếp của cùng một thí nghiệm viên và cùng một phương pháp phân tích. Độ tái lặp có thể xác định thơng qua độ lệch chuẩn (SD) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD %) của các phép phân tích lặp lại trong 8 ngày liên tiếp cũng với mức nồng độ 10-HDA 20 mg/L. Đối với phương pháp CE, độ lặp lại thường được xác định đối với thời gian di chuyển và diện tích pic. Kết quả đo được tổng hợp và xử lý tính tốn qua phương pháp thống kê.
Cơng thức tính độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD %) như sau: 𝑆𝐷 = √∑(𝑠𝑖 − 𝑠𝑡𝑏) 2 𝑛 − 1 𝑆𝐷(%) =𝑆𝐷 𝑆𝑡𝑏× 100 Trong đó:
Si: là diện tích pic điện di thứ i
Stb: là diện tích pic trung bình của n lần chạy n: là số lần chạy lặp
Độ đúng (Độ thu hồi) của phương pháp
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu được chấp nhận. Do đó, thước đo độ đúng thường đánh giá qua sai số tương đối hay bằng cách xác định độ thu hồi của mẫu thêm chuẩn vào nền sữa ong chúa tươi với mức nồng độ thêm tương đương 20 mg/L 10-HDA trong dung dịch bơm và mẫu thêm chuẩn vào nền sữa ong chúa đông khô dạng gel với mức nồng độ thêm tương đương 5 mg/L 10-HDA trong dịch bơm. Độ thu hồi thường được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn với cơng thức tính như sau :
H(%) =Cm+c − Cm
Cc 𝗑 100
Trong đó :
Cm+c : Nồng độ trong mẫu thêm chuẩn (mg/mL) Cm : Nồng độ trong mẫu (mg/mL)
Cc : Nồng độ chuẩn thêm (mg/mL)
So sánh với phương pháp HPLC
Mẫu sau khi được xử lí giống với phương pháp CE-C4D sẽ được bơm vào thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 20AB Shimadzu và phân tích theo các điều kiện như sau : pha động sử dụng là hỗn hợp metanol / nuóc (55 : 45, v : v) được điều chỉnh đến pH = 2,5 bằng axit photphoric, tốc độ dòng pha động là 1 mL / phút theo chế độ đẳng dịng, cột phân tích RP-C18 : 25 cm x 4,6 mm x 5 µm ở nhiệt độ 38oC, 10-HDA được nhận biết tại bước sóng hấp thụ 210 nm.
2.4. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 2.2.2 Dụng cụ và thiết bị
- Các loại bình định mức: 10, 25, 50, 100, 250, 1000 mL và micropipet các loại 100, 200, 1000, 5000 µL.
- Máy đo pH và độ dẫn
- Giấy lọc nilon, giấy lọc PTFE, giấy lọc xenluloso axetat cỡ lỗ 2 µm. - Cân phân tích 4 số, Shimadzu, Nhật Bản.
- Máy nước cất deion Milipore – Simplicity UV (USA). - Xy lanh, kẹp giá đỡ.
- Cột mao quản silica nóng chảy đường kính trong 50 µm, đường kính ngồi là 365 µm với độ dài tổng 60 cm và độ dài hiệu dụng 48 cm (Agilent, Mỹ). - Hệ điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc vận hành bằng
tay (manual CE-C4D), Trung tâm nghiên cứu Công nghệ môi trường và phát triển bền vững (CETASD), Truòng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà nội. Hệ thiết bị sử dụng nguồn cao thế ± 30 kV (Spellman, Anh), ghi dữ liệu nhờ bộ ghi e-corder (eDAQ, Úc)
- Thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC-DAD 20AB, Shimadzu
2.3.2 Hóa Chất
Tất cả hóa chất đều có độ tinh khiết phân tích, các hóa chất cần sử dụng bao gồm
- Dung dịch chuẩn gốc (1000 mg/L) của 10-HDA từ Tokyo Chemical Industry (Nhật Bản) được sử dụng để pha các dung dịch chuẩn.
- Các hóa chất dùng để pha dung dịch điện li nền (BGE) bao gồm: axit axetic (Ace), axit lactic (Lac), hydroxymetyl aminometan (Tris), axit 2-(N- morpholino) etanesulfonic (MES), axit 2-(N-morpholino) etanesulfonic (MOPS), axít N-Cyclohexyl-2-aminoetanesulfonic (CHES) từ Sigma-Aldrich Tris (hydroxymethyl aminomethane) ≥ 99,8% có CTPT: C4H11NO3, M = 121,136 g/mol, công thức cấu tạo như sau:
MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) có CTPT: C6H13NO4S, M = 195,2 g/mol, công thức cấu tạo như sau:
MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) có CTPT: C7H15NO4S, M = 209,26 g/mol, công thức cấu tạo như sau:
CHES (N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid) có CTPT: C8H17NO3S, M = 207,287 g/mol, công thứ cấu tạo như sau:
- Nước deion được dùng để pha các dung dịch chuẩn và xử lý mẫu, lấy từ máy lọc nước Simplicity UV, Millipore (USA).
- Dung môi etanol, methanol, isopropanol dùng trong phân tích (Merck)
2.4. Thơng tin mẫu thực
Có tất cả 7 mẫu được sử dụng trong nghiên cứu, bao gồm các dạng mẫu: sữa ong chúa tươi, sữa ong chúa đơng khơ, mẫu mật ong có bổ sung thêm sữa ong chúa. Dưới đây là thông tin chi tiết về các mẫu:
Bảng 2.1 Thông tin về các mẫu được nghiên cứu
Loại mẫu Code
mẫu Nhãn hiệu Ghi nhãn
Sữa ong chúa tươi Mẫu 1
Sữa ong chúa - HONECO Công ty Ong
Tam Đảo
Sữa ong chúa tươi nguyên chất
Mẫu 2 Sữa ong chúa Sữa ong chúa
tươi nguyên chất
Viên nang sữa ong chúa đông khô dạng bột
Mẫu 3 Omanly - HONECO
Công ty Ong Tam Đảo
450 mg sữa ong chúa và ấu trùng ong chúa đông
khô 50 mg tá dược
Viên nang sữa ong chúa đông
khô dạng gel Mẫu 4 Royal Jelly 1000 mg– Blossom, DJ Health Group Pty Ltd, Úc 183,3 mg sữa ong chúa đông
khô (3:1) 6% 10-HAD tương đương 11 mg 10-HDA Mẫu 5 Royal Jelly 1610 mg– Costa, Star Combo Pty
Ltd Company, Úc
Chuẩn bị mẫu
Đối với mẫu sữa ong chúa tươi, cân chính xác một lượng khoảng 1,0 g và tiến hành hòa tan, định mức tới 50 mL bằng dung mơi thích hợp, sau đó đem đi ly tâm trong 15 phút với tốc độ 1500 rpm. Sản phẩm thu được đem lọc qua màng lọc nilon 0,2 µm trước khi bơm vào thiết bị CE - C4D.
Đối với các mẫu viên nang: 10 viên nang mẫu được trích, loại bỏ phim, dịch