Các điều kiện điện di: thời gian bơm mẫu 30 s; mao quản silica nóng chảy I.D = 50 µm, Ltot = 60 cm, Leff = 48 cm.
Từ các kết quả trên hình cho thấy, khi thay đổi thế tách từ - 10kV đến - 19kV, thời gian di chuyển của chất phân tích giảm đi và diện tích pic cũng giảm đi tương ứng, điều này phù hợp với cơ sở lý thuyết. Do đó, để tối ưu độ phân giải, thời gian phân tích, đảm bảo ổn định thiết bị, kết hợp với tín hiệu phân tích thu được, thế tách tối ưu được lựa chọn là - 17kV. Do đó, thế - 17kV là điều kiện tối ưu trong nghiên cứu này để thực hiện các khảo sát tiếp theo.
Điều kiện tối ưu cho phân tích 10-HDA được thể hiện trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Điều kiện thiết bị điện di mao quản
Các yếu tố Điều kiện
Detector CE-C4D
Mao quản Silica nóng chảy; đường kính trong 50 µm, đường kính ngồi 365 µm; chiều dài tổng là 60 cm, chiều dài hiệu dụng 48 cm
Phương pháo bơm Thủy động lực học kiểu xi phông, chiều cao 20 cm Thời gian bơm mẫu 30 s
Dung dịch đệm Tris/Ace (20 mM, pH = 8,5)
Thế tách - 17 kV
3.2. Khảo sát và tối ưu quy trình xử lí mẫu
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của giấy lọc và quy trình ly tâm đến diện tích pic của 10 – HDA
Sử dụng các điều kiện tối ưu khi phân tích 10-HDA trên thiết bị CE đã được khảo sát là: điều kiện của cột mao quản, dung mơi, thể tích bơm mẫu, cùng một mẫu phân tích và dung mơi hịa tan là nước deion để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của giấy lọc và quy trình ly tâm đến việc tách 10-HDA trong nền sữa ong chúa. Cân chính xác khoảng 1 g mẫu sữa ong chúa tươi (mãu 1), hòa tan với 50 mL nước deion, lắc rồi chia làm 2 phần: phần 1 ly tâm 15 phút với tốc độ 1500 rpm, phần 2 không ly tâm. Đem lọc dịch của mỗi phần với từng loại giấy lọc: nilon, PTFE, xenlulozo axetat có cỡ lỗ 0,2 µm, sau đó bơm dịch lọc vào thiết bị CE-C4D để phân tích 10-HDA, diện tích pic thu được hiệu chuẩn với từng khối lượng thực của mẫu. Kết quả được thể hiện trên hình 3.7
Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của giấy lọc và quy trình ly tâm đến diện tích
Hình 3.8. Điện di đồ phân tích 10-HDA với ly tâm 1500 rpm trong 15 phút, lọc
bằng PTFE, nilon và xenlulozo axetat.
Hình 3.9. Điện di đồ phân tích 10-HDA với khơng ly tâm, lọc bằng PTFE, nilon và
Từ hình 3.7 – 3.9, ta thấy rằng sau khi hòa tan mẫu, mẫu được đem đi ly tâm thì diện tích pic của 10-HDA sẽ cao hơn khi mẫu không được ly tâm mà đem đi lọc ngay. Do đó, quy trình ly tâm trong 15 phút với tốc độ 1500 rpm được lựa chọn để làm điều kiện tối ưu cho các khảo sát tiếp theo.
Ngoài ra, khi lọc với các loại giấy lọc khác nhau thì loại giấy lọc PTFE và nilon là đều cho diện tích pic của 10-HDA cao và tương tự nhau, nhưng do giấy lọc PTFE có giá thành đắt và khó mua. Nên giấy lọc nilon với giá thành rẻ và dễ mua ở Việt Nam hơn nên được sử dụng làm điều kiện tối ưu cho các khảo sát tiếp theo.
3.2.2. Khảo sát dung mơi hịa tan
Sau khi khảo sát và lựa chọn được giấy lọc, tiến hành khảo sát dung mơi hịa tan. Đầu tiên là phải khảo sát lựa chọn dung môi, 4 loại dung môi được lựa chọn là: nước deion, isopropanol, etanol, metanol với tỉ lệ 50% dung mơi : 50% nước (v:v) và 100% nước. Cân chính xác khoảng 1 g với từng dạng mẫu: sữa ong chúa tươi (mẫu 1), sữa ong chúa dạng đông khô dạng bột (mẫu 3) và sữa ong chúa dạng gel (mẫu 4); hòa tan với 50 mL hỗn hợp dung môi : nước deion (1:1, v:v); lắc, ly tâm 1500 rpm trong 15 phút; lọc bằng giấy lọc nilon 0,2 µm. Sau đó, bơm dịch lọc vào thiết bị CE- C4D để phân tích 10-HDA. Mỗi mẫu được tiến hành 3 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm được đo trên hệ điện di 3 lần. Diện píc pic thu được hiệu chuẩn với khối lượng thực của từng mẫu. Kết quả trung bình thu được thể hiện trong hình 3.10.
Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện diện tích pic trung bình của 10-HDA với các dung mơi
hịa tan
Từ các kết quả khảo sát cho thấy diện tích pic của 10-HDA của 3 hệ dung môi là metanol : nước, etanol : nước, isopropanol : nước trong mỗi loại mẫu đều tương tự nhau và đều tốt hơn 100% nước deion. Đặc biệt là dung môi metanol với 10-HDA ở cả 3 dạng mẫu đều cho kết quả là tốt nhất, pic lên rõ nét, đường nền ổn định. Bởi vậy, hệ dung môi metanol : nước được chọn làm điều kiện chiết để tiến hành các khảo sát tiếp theo.
3.2.3. Khảo sát tỉ lệ thành phần dung mơi hịa tan
Sau khi chọn được dung mơi hịa tan là hệ dung mơi metanol và nước, cần thiết phải khảo sát và tối ưu hóa tỉ lệ thành phần của hỗn hợp dung môi này, tỉ lệ dung môi metanol và nước trong hệ dung môi (% metanol : % nước) thay đổi từ 10 : 90, 25 : 75, 30 : 70, 40 : 60, 50 : 50, 75 : 25. Trong quá trình khảo sát giữ nguyên điều kiện tối ưu của thiết bị, điều kiện dung dịch đệm và được tiến hành trên cùng một mẫu sữa ong chúa dạng gel (mẫu 4). Mỗi dung dịch mẫu được tiến hành 3 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm được đo trên hệ điện di 3 lần.
Bảng 3.2. Khảo sát diện tích pic của 10-HDA trung bình với các tỉ lệ dung mơi
khác nhau
Tỉ lệ dung môi metanol : nước (v:v)
Diện tích pic đã được hiệu chuẩn (V.s) 10:90 0,21 ± 0,11 25:75 0,19 ± 0,13 30:70 0,22 ± 0,03 40:60 0,20 ± 0,15 50:50 0,20 ± 0,11 75:25 0,19 ± 0,10
Hình 3.12. Điện di đồ phân tích 10-HDA với các tỉ lệ dung môi chiết khác
Kết quả trên hình 3.12 và bảng 3.2 cho thấy khi tỉ lệ dung môi metanol trong hỗn hợp tăng đến 30% và tỉ lệ nước giảm xuống thì diện tích pic của 10-HDA có xu hướng tăng. Nhưng nếu tiếp tục tăng thể tích metanol đến 50% thì diện tích pic 10- HDA lại có xu hướng giảm. Và khi tiếp tục tăng thể tích metanol thì ta thu được diện tích pic vẫn tiếp tục giảm nhưng giảm chậm và gần như không đổi. Đặc biệt, ở tỉ lệ 30% metanol và 70% nước ta nhận được kết quả hòa tan tốt nhất, với đường nền ổn định nhất và tín hiệu có độ lặp lại cao hơn các tỉ lệ hịa tan mẫu khác. Do đó, tỉ lệ dung mơi metanol với nước là 30 : 70 được lựa chọn là điều kiện tối ưu cho việc hòa tan mẫu sữa ong chúa, trước khi ly tâm, lọc để phân tích.
3.3. Đánh giá phương pháp phân tích
3.3.1. Xây dựng đường chuẩn, xác định hệ số tương quan Xây dựng đường chuẩn Xây dựng đường chuẩn
Các dung dịch dùng để dựng đường chuẩn được pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc. Các dung dịch này có nồng độ biến thiên trong khoảng 5 pm – 100 ppm. Mỗi dung dịch được đo lặp lại trên hệ điện di 3 lần, diện tích pic trung bình thu được sẽ là số liệu để dựng đường chuẩn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ. Các điều kiện đo trên cơ sở điều kiện tối ưu nêu ở bảng trên và diện tích pic trung bình của các chất thu được như trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ 10-HAD STT Nồng độ (ppm) Diện tích pic (V.s) 1 2 0.002036 2 5 0.004789 3 10 0.01011 4 20 0.018728 5 30 0.02806 6 50 0.047078 7 100 0.096311
Từ kết quả thu được và sử dụng phần mềm excel để xử lí số liệu thì thu được một đường chuẩn được thể hiện trong hình 3.10.
Hình 3.13. Đường chuẩn của 10-HDA
y = 0.001x - 0.0002 R² = 0.9997 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0 20 40 60 80 100 120 D iệ n tí ch p ic ( V .s) Nồng độ 10-HDA
Giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL), giới hạn phát hiện (MDL) và giới hạn định lượng (MQL) của phương pháp
Dựa vào cách tính ở mục 2.3, thì thu được tại nồng độ nhỏ nhất có thể đo được tín hiệu của từng nguyên tố và tín hiệu S/N.
Giá trị MDL trong sữa ong chúa tươi được xác định trên cơ sở chiều cao pic gấp 3 lần nhiễu nền và hệ số quy đổi với 1 gam mẫu hòa tan vào 50 mL nước deion.
MQL được tính từ giá trị giới hạn định lượng của thiết bị và quy đổi tương ứng hòa tan 1,0 g mẫu vào 50 mL nước deion.
𝑀𝑄𝐿 = 𝐼𝑄𝐿 × 50 1000 × 𝑚 Trong đó:
MQL: giới hạn định lượng của phương pháp (mg/g) IQL: giới hạn định lượng của thiết bị (mg/L)
m: khối lượng mẫu (g)
Bảng 3.4. Các thông số đánh giá phương pháp
Khoảng đường chuẩn (mg/L) Hệ số tương quan (R2) Phương trình đường chuẩn MDL (mg/g) MQL (mg/g) 10-HDA 5 - 100 0,9997 y = 0.001x - 0.0002 0,039 0,13 3.3.2. Đánh giá độ chụm
Để đánh giá độ chụm của phương pháp, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại và độ tái lặp của 10-HDA trên nền mẫu thực. Độ chụm được đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối về diện tích pic và thời gian lưu của tín hiệu 10-HDA khi phân tích
lặp lại với 7 lần bơm độc lập đối với độ lặp lại và với 8 ngày liên tiếp với độ tái lặp, mẫu chuẩn nồng độ 20 mg/L trên nền nước deion. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.5. Giá trị độ lệch chuẩn Độ lặp lại (n=7) Độ tái lặp (8 ngày) RSD % đối với diện tích pic RSD % đối với thời gian
di chuyển
RSD % đối với diện tích pic
RSD % đối với thời gian
di chuyển
10-HDA 2,24 0,26 8,48 3,18
Từ bảng trên, nhận thấy rằng khi tiến hành đo lặp lại 7 lần 10-HDA thì RSD đối với diện tích pic và với thời gian di chuyển đều tốt (RSD < 3%). Ngoài ra, khi tiến hành độ tái lặp, RSD cũng tốt với cả diện tích pic và thời gian di chuyển (RSD < 9%). Chứng tỏ rằng phương pháp có độ chụm tốt và đáng tin cậy.
3.3.3. Độ đúng (độ thu hồi)
Độ đúng của phương phá được đánh giá qua hiệu suất thu hồi của phương pháp phân tích, bao gồm cả xử lý và đo mẫu phân tích, thơng qua phương pháp thêm chuẩn. Mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 20 mg/L bằng cách thêm chuẩn trực tiếp vào nền mẫu thực trước khi xử lý mẫu, và xử lý mẫu tương tự như xử lý mẫu thực, sau đó tiến hành phân tích trên thiết bị điện di mao quản một kênh vận hành bằng tay. Kết quả thu được trong bảng 3.7:
Bảng 3.6. Hiệu suất thu hồi của 10-HDA
Dạng mẫu
Hiệu suất thu hồi của 10-HDA (%)
Dạng sữa ong chúa tươi (mẫu 1) 105,77
Dạng bột (mẫu 3) 99,89
Dạng gel (mẫu 4) 97,23
Hiệu suất thu hồi trung bình (%) 97-106
Hình 3.14. Điện di đồ phân tích 10-HDA trong mẫu chuẩn, mẫu thực và mẫu
thêm chuẩn.
Các điều kiện điện: di thế tách -17 kV; thời gian bơm mẫu 30 s; mao quản silica nóng chảy I.D = 50 µm, Ltot = 60 cm, Leff = 48 cm, đệm Tris/Ace 20 mM pH 8,5
Như vậy, hiệu suất thu hồi của phương pháp sau khi khảo sát với 3 loại nền khác nhau là nền sữa ong chúa tươi, nền dạng bột khô và nền dạng gel cô đặc. Điều này chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao, quy trình phân tích phù hợp cho việc xác định hàm lượng 10-HDA trong các mẫu sữa ong chúa.
3.3.4. So sánh với phương pháp tiêu chuẩn HPLC
Việc phân tích đối chứng một số mẫu thực tế được thực hiện với 5/7 mẫu thực tế có phát hiện 10-HDA ( gồm: hai mẫu sữa ong chúa tươi, một mẫu dạng bột, ba mẫu dạng gel và một mẫu mật ong) bằng phương pháp tiêu chuẩn Sắc kí lỏng Hiệu năng cao (HPLC-DAD) tại Trung tâm CETASD. Các kết quả đối chứng được nêu trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả so sánh giữa CE-C4D và HPLC với số mẫu thực tế
Loại mẫu Mã mẫu
Hàm lượng 10-HDA (mg/g)
CE (n=3) HPLC Độ chênh
lệch (%) Sữa ong chúa
tươi
Mẫu 1 21,38 ± 0,89 21,52 - 0,66
Mẫu 2 9,14 ± 0,27 -
Viên nang sữa ong chúa đông khô dạng bột
Mẫu 3 13,20 ± 0,30 13,77 - 4,14
Viên nang sữa ong chúa đông
khô dạng gel Mẫu 4 0,54 ± 0,01 - Mẫu 5 < 0,13 <0,36 Mẫu 6 2,58 ± 0,07 2,60 - 0,73 Mật ong sữa chúa Mẫu 7 1,72 ± 0,04 1,65 4,24 LOQ 0,13 0,036
- : khơng phân tích
Độ chênh lệch = {(CCE-C4D – CHPLC) / CHPLC} 𝖷 100%
3.3.5. Phân tích mẫu thực tế
Sau khi xây dựng đường chuẩn và đánh giá phương pháp, 7 mẫu thật (bao gồm 2 mẫu sữa ong chúa tươi, 1 mẫu viên nang sữa ong chúa đông khô dạng bột, 3 mẫu viên nang sữa ong chúa đông khô dạng gel, 1 mẫu mật ong sữa chúa) đã được phân tích nhằm định lượng 10-HDA trong thành phần. Giản đồ điện di phân tích một số mẫu được minh họa trên hình 3.12
Hình 3.15. Điện di đồ phân tích 10-HDA trong một số mẫu sản phẩm sữa ong chúa;
mẫu 1: sữa ong chúa tươi, mẫu 3: sữa ong chúa/ấu trùng đông khô dạng bột, mẫu 4 và 5: sữa ong chúa đông khô dạng gel , mẫu 7: mật ong sữa chúa
Các điều kiện điện: di thế tách -17 kV; thời gian bơm mẫu 30 s; mao quản silica nóng chảy I.D = 50 µm, Ltot = 60 cm, Leff = 48 cm, đệm Tris/Ace 20 mM pH 8,5
Các kết quả phân tích mẫu thực thu được trong bảng 3.8 cho thấy hàm lượng 10- HDA phát hiện được trong khoảng 0,9% - 2,3% đối với sữa ong chúa tươi, các giá trị này là tương đối phù hợp với khoảng giá trị thông thường từ 1,5 – 2% và tiêu chuẩn một số quốc gia quy định là 1,4%. Trong các mẫu viên nang sữa ong chúa đông khô dạng gel nhập khẩu mặc dù ghi nhãn hầu hết là sữa ong chúa đông khô theo tỷ lệ 1:3,
tức là hàm lượng 10-HDA sẽ cao hơn trong sữa tươi cỡ 3 lần, tương đương khoảng 6% nhưng trên thực tế khi phân tích hàm lượng 10-HDA chỉ có 0,05 – 0,26%. Cá biệt mẫu số 5 không phát hiện thấy 10-HDA (cả bằng phương pháp HPLC) cũng như không phát hiện thấy thành phần amino axit tự do khi phân tích (khơng trình bày kết quả ở đây) cho thấy đây có thể là sản phẩm giả mạo (sản phẩm này được mua qua shop online). Trong mật ong sữa chúa, thành phần sữa ong chúa ghi nhãn là 10%, tìm thấy hàm lượng 10-HDA là 0,17% là khá phù hợp với tỷ lệ pha cũng như hàm lượng thông thường của 10-HDA trong sữa ong chúa tươi. Các kết quả phân tích so sánh bằng phương pháp truyền thống HPLC cho thấy sai lệch giữa kết quả thu được từ hai phương pháp phân tích trong khoảng < ± 5% đã chứng minh được độ tin cậy khi sử dụng phương pháp CE-C4D cho đối tượng 10-HDA.
KẾT LUẬN
Trong phạm vi nghiên cứu với mục tiêu đề ra là nghiên cứu xây dựng được phương pháp điện di mao quản để xác định hàm lượng 10-HDA trong sản phẩm chứa sữa ong chúa, đề tài đã đạt được những kết quả sau:
1. Đã phát triển được quy trình phân tích 10-HDA trong sản phẩm chứa sữa ong chúa bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn khơng tiếp xúc. Quy trình bao gồm bước xử lý mẫu: mẫu được cân chính xác một khối lượng (cỡ 1 g), hòa tan vào 50 ml metanol : nước deion (tỉ lệ thể tích 30:70), lắc, ly tâm 1500 rpm trong 15 phút, lọc bằng màng lọc nilon 0,2µm trước khi phân tích bằng thiết bị CE-C4D. Các điều kiện phân tích điện di như sau: dung dịch đệm điện di là 20 mM Tris/Ace (pH = 8,5), thế điện di -17 kV, thời gian