CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp thực nghiệm trong phịng thí nghiệm
2.2.2.1. Phương pháp phân lập nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao
- Phương pháp phân lập Phytophthora: Sử dụng mồi bẫy Phytophthora (Sử dụng một số loại quả như: đu đủ, ca cao, táo, lê …thường phải xanh làm mồi bẫy) từ đất quanh vùng rễ cây bị bệnh hoặc từ mô cây bệnh (Erwin and Riberrio, 1996).
- Bẫy Phytophthora từ đất quanh vùng rễ cây bị bệnh.
+ Chọn đất ẩm trên bề mặt 5 cm của lớp đất dưới lớp rác lá, trong đó có rễ cây. + Đục những lỗ nhỏ bán kính 2 cm trên vỏ trái ca cao xanh hoặc các trái cây khác. + Nhét đất ẩm vào các lỗ vừa đục trên quả dùng làm mỗi bẫy.
+ Bọc quả trong túi nilon và đặt trong điều kiện phòng.
+ Kiểm tra quả hàng ngày nếu là bệnh do nấm Phytophthora gây ra thì phần thương tổn màu nâu lan rộng nhưng không thối nhũn.
+ Cắt khúc nhỏ ở rìa thương tổn, cho vào đĩa agar đã chuẩn bị sẵn để phân lập - Bẫy Phytophthora từ mô cây bị bệnh thối đen quả ca cao.
+ Chọn mô nằm ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ.
+ Thanh trùng bề mặt bằng ethanol 70% hoặc HgCl2 (1%) khoảng 30 - 60 giây. Rửa sạch với nước cất và lau khô bằng giấy đã được khử trùng.
+ Cắt mô thành miếng nhỏ (< 5 mm).
+ Thanh trùng bề mặt quả trái cây, rạch quả và chèn mô bệnh đã thanh trùng vào. + Bọc trái mồi bẫy vào trong túi ni lon để trong nhiệt độ phòng.
+ Kiểm tra túi ủ hàng ngày, sau 2 - 3 ngày thấy vết thương tổn màu nâu lan rộng chứng tỏ có bị nhiễm Phytophthora.
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
+ Cắt khúc nhỏ ở rìa thương tổn, cho vào đĩa agar đã chuẩn bị sẵn để phân lập
2.2.2.2. Phân lập Trichoderma từ đất ở các vùng trồng ca cao
- Phân lập nấm Trichoderma theo phương pháp của Samuels (2004).
Các mẫu rễ và đất vùng rễ của ca cao thu thập trên đồng ruộng được rửa sạch qua vòi nước và khử trùng bề mặt bằng cồn 950 trong 30 giây sau đó rửa bằng cồn 750 trong 2 phút, cuối cùng rửa sạch lại 3 lần bằng nước cất khử trùng và cấy vào môi trường TME, CMA và PRBA. Mẫu đất được pha lỗng và cấy trên mơi trường TME và PRBA. Các mẫu cấy được ủ ở 250C sau đó được tách thuần trên môi trường PDA.
2.2.2.3. Xác định khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp. đối với nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao.
Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp. với nấm Phytophthora sp. được đánh giá theo phương pháp của Seiketov (1982), Bradshaw-Smith và cộng sự (1991). + Mơi trường thí nghiệm: PDA
+ Phương pháp tiến hành: Cấy đối xứng hai bên
+ Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính ức chế của tản nấm Trichoderma sp. đối với Phytophthora sp.
Kẻ một đường ở giữa đĩa petri (phần đáy). Cấy nấm Trichoderma và nấm Phytophthora palmivora trên 2 điểm đối xứng nhau trên đường vừa kẻ. Ủ ở nhiệt
độ phòng, theo dõi tốc độ sinh trưởng và phát triển của nấm Trichoderma và chủng nấm Phytophthora palmivora.
Tìm hiểu khả năng ức chế của nấm Trichoderma sp. đối với nấm gây bệnh bằng chất kháng sinh bay hơi: dựng 2 đĩa có đường kính bằng nhau, trên mơi trường PDA, một đĩa cấy nấm gây bệnh, một đĩa cấy nấm Trichoderma sp., úp 2 đĩa vào nhau và giữ kín hộp đĩa. Đối chứng là cặp Petri cấy nấm gây bệnh. Theo
Nấm bệnh Phytophthora
palmivora Nấm đối kháng
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
dõi sự sinh trưởng, phát triển của từng loại nấm và khả năng ức chế nấm gây bệnh bởi chất kháng sinh bay hơi do nấm Trichoderma sinh ra.
2.2.2.4. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh học và sinh thái của nấm Trichoderma sp.
+ Thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy. Trong điều kiện phịng thí nghiệm, để ni cấy nấm Trichoderma có thể sử dụng các môi trường dinh
dưỡng tổng hợp lỏng hoặc rắn (có agar) hoặc các nguồn tự nhiên khác từ thực vật (các hạt ngũ cốc phế thải, kho dầu củ cải đường). Có thể nuôi cấy nấm
Trichoderma bằng phương pháp cấy chìm hoặc cấy trên bề mặt môi trường. Các
nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành theo phương pháp cấy nấm trên bề mặt mơi trường có agar.
Nấm Trichoderma sp. được cấy trên một số mơi trường ni cấy thích hợp với nấm đối kháng như PDA, CMA, Chapek. Sau đó được đặt ở điều kiện nhiệt độ: 250C.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng khác nhau đến sinh trưởng phát triển của nấm đối kháng: thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Seketov (1982). Thí nghiệm bao gồm các cơng thức: tối liên tục, sáng liên tục, 12 giờ sáng và 12 giờ tối.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của các độ pH môi trường nuôi cấy đến khả năng phát triển của nấm Trichoderma sp.: các giá trị pH của môi trường nuôi cấy được
thí nghiệm là 4, 5, 6, 7, 8.
+ Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ: Nấm được cấy trên mơi trường PDA có độ pH thích hợp (pH = 5 – 6) và đặt ở nhiệt độ: 20, 25, 30, 35, 400C.
Chỉ tiêu theo dõi (cho cả 4 thí nghiệm trên): Đường kính khuẩn lạc sau 1, 2, 3 và 4 ngày (cm).
+ Phương pháp định tính hoạt độ enzym chitinase, β-glucanase và cellulase của nấm Trichoderma.
Hoạt độ các enzym chitanase, ß-glucanase và cellulase của nấm
Trichoderma được định tính bằng cách đo đường kính vịng phân giải trên môi
trường cảm ứng tổng hợp của từng loại enzym (Vi sinh vật học, Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
Môi trường cảm ứng tổng hợp enzym chitinase và β-glucanase :
Urê 0,3g (NH4)2SO4 1,4g MgSO4.7H2O 0,3g CaCl2.6H2O 0,3g Glucose 0,5g β- Glucan 2g
hoặc huyền phù chitin 10g Fe2+, Mn2+, Zn2+, Co2+ 0,1% (v/v)
Nước cất 1000 ml
Môi trường cảm ứng tổng hợp enzym cellulase:
K2HPO4 2 g (NH4)2SO4 2 g
NaCl 2 g MgSO4. 7H2O 2 g Agar 15g CMC (cacboxyl methyl cellulose) 10 g Nước cất 1000 ml pH = 7,0 - 7,2.
- Phương pháp tiến hành: đổ môi trường vào đĩa Petri, cấy vi khuẩn mới hoạt hố trên mơi trường, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 1- 4 tuần và quan sát vòng phân giải được tạo ra bằng dung dịch thuốc thử Lugol.
2.2.3.4. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để sản xuất chế phẩm Trichoderma sp. đối kháng với nấm Phytophthora sp. tác nhân chính gây bệnh thối quả ca cao
Phương pháp tiến hành: Áp dụng phương pháp nhân sinh khối nấm
Trichoderma của Papavizas và cộng sự (1984) có cải tiến (mỗi công thức làm nhắc
lại 3 lần). Nấm Trichoderma được nuôi cấy trên môi trường PDA 5 - 7 ngày. Môi trường nhân sinh khối được hấp khử trùng trong 45 phút ở 1210C. Cấy nấm
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
15 ngày.
a) Nghiên cứu thành phần cơ chất của môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma sp. Cơng thức thí nghiệm CT1: 250g gạo CT2: 250g bột ngô CT3: 125g gạo + 125g bột ngô CT4: 250g thóc
Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)
b) Nghiên cứu lượng nước trong môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma sp.
Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm
Trichoderma trên mơi trường gạo
Cơng thức thí nghiệm
CT5: 250g gạo + 50ml nước CT6: 250g gạo + 100ml nước CT7: 250g gạo + 150ml nước CT8: 250g gạo + 200ml nước
Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)
Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm
Trichoderma trên môi trường bột ngơ
Cơng thức thí nghiệm CT9: 250g ngô + 50ml nước CT10: 250g ngô + 100ml nước CT11: 250g ngô + 150ml nước CT12: 250g ngô + 200ml nước CT13: 250g ngô + 250ml nước
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm
Trichoderma trên mơi trường thóc
Cơng thức thí nghiệm CT14: 200g thóc + 100ml nước CT15: 200g thóc + 150ml nước CT16: 200g thóc + 200ml nước CT17: 200g thóc + 250ml nước CT18: 200g thóc + 300ml nước
Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)
c) Nghiên cứu xác định chế độ cấp khí trong lên men nhân sinh khối
Ảnh hưởng của chế độ đậy nút kín và cấp khí đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma
Cơng thức thí nghiệm
CT19: Đối chứng (Đậy nút kín khơng đảo) CT20: Đậy nút kín + đảo trộn 1 ngày/1 lần CT21: Đậy nút kín + đảo trộn 2 ngày/1 lần CT22: Đậy nút kín + đảo trộn 3 ngày/1 lần
Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)
Ảnh hưởng của chế độ buộc nút hở và cấp khí đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma
Công thức thí nghiệm
CT23: Buộc nút hở + Đối chứng không đảo
CT24: Buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí 1 lần sau 3 ngày
CT25: Buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí 2 lần sau 3 ngày và 10 ngày
CT26: Buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí 3 lần sau 3 ngày, 8 ngày và 13 ngày CT27: Buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí 4 lần, 3 ngày/ lần
CT28: Buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí liên tục, 1 ngày/ lần
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma Cơng thức thí nghiệm.
CT29: Sáng liên tục
CT30: 12 giờ sáng + 12 giờ tối CT31: Tối liên tục
Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)