3.5. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm
Trichoderma sp. đối kháng với nấm Phytophthora palmivora gây thối đen quả ca cao.
Bên cạnh việc nghiên cứu tuyển chọn được các dòng nấm Trichoderma đối kháng có hoạt tính cao, việc nghiên cứu mơi trường nhân sinh khối lớn để có chế phẩm ứng dụng trong phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng là quan trọng. Môi trường nhân sinh khối và các điều kiện nhân phải bảo đảm trong thời gian ngắn có thể đảm bảo khối lượng lớn để cung cấp ra ngồi thị trường. Bên cạnh đó nghiên cứu mơi trường nhân ni thích hợp sẽ đảm bảo được chất lượng của vi sinh vật đối kháng. Một số nghiên cứu của Viện Bảo vệ Thực vật trước đây cũng cho thấy môi trường ngũ cốc là mơi trường thích hợp cho nấm Trichoderma sp. phát triển. Tuy nhiên
trước đây sản xuất trong điều kiện lọ và bình thủy tinh, số lượng sinh khối nhân lên chậm hơn nhiều không đáp ứng được trong điều kiện sản xuất yêu cầu với số lượng lớn.
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
Đề tài tiến hành nghiên cứu môi trường và điều kiện nhân sinh khối thích hợp, nhằm nâng cao sức sản xuất chế phẩm đáp ứng nhu cầu của sản xuất.
3.5.1. Nghiên cứu thành phần cơ chất của môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma sp. nấm Trichoderma sp.
Để nghiên cứu môi trường nhân sinh khối thích hợp chúng tơi chọn các loại ngũ cốc với giá thành hợp lý từ 5 – 10 nghìn đồng/kg, khơng bị hạn chế về nguồn nguyên liệu, có thể đảm bảo nguồn cung cấp khi sản xuất với số lượng lớn làm môi trường nhân sinh khối. Các loại mơi trường gạo, thóc, ngơ, gạo trộn ngô được sử dụng làm mơi trường nhân sinh khối trong thí nghiệm. Kết quả ảnh hưởng của môi trường nhân sinh khối đến sự sinh trưởng, phát triển của Trichoderma sp. được trình bày trong bảng 3.11.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma sp. Nguồn nấm Trichoderma Công thức môi trường Chỉ tiêu
Số bào tử/g Ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)
Tr-tv CT1 37 x 108 b 3 - 4 CT2 19 x 108 a 3 - 4 CT3 21 x 108 a 3 - 4 CT4 53 x 108 c 3 - 4 CV (%) 12,5 Tr-H CT1 46 x 108 b 3 - 4 CT2 20 x 108 a 3 - 4 CT3 23 x 108 a 3 - 4 CT4 54 x 108 c 3 – 4 CV (%) 6,9 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
CV: Độ biến động (%)
Cả 2 dịng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao (Tr-H, Tr- tv) được tuyển chọn đều phát triển tốt trên cả 4 loại mơi trường thí nghiệm, sau 1 – 2 ngày
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
sợi nấm mọc lan nhanh trên bề mặt, sau 3 – 4 ngày sau cấy bào tử nấm xuất hiện, bề mặt chế phẩm có màu xanh nhạt, sau đó chế phẩm phát triển mạnh sẽ chuyển màu xanh nhạt thành xanh đậm. Tuy nhiên khi đếm mật độ bào tử có xử lý thống kê cho thấy các cơng thức cũng có sự sai khác. Mơi trường thóc có độ xốp cao, thống khí hơn, cho mật độ bào tử cao nhất (54 x 108 bào tử/g), sau 15 ngày nhân ni bào tử mọc kín có màu xanh đậm, sau đó đến mơi trường gạo (46 x 108 bào tử/g), môi trường bột ngô không tơi xốp, khi nấm phát triển trên lớp bề mặt thì cũng xanh đều, nhưng khi đảo để nấm phát triển bên trong sinh khối thì kém hơn, vì vậy cho mật độ bào tử thấp hơn (20 x 108 bào tử/g). Mặc dù vậy, tùy theo yêu cầu chế phẩm được sử dụng trong điều kiện nào chúng ta sẽ chọn môi trường nhân ni cho thích hợp, nếu sử dụng cho chế phẩm bón gốc thì có thể nhân sinh khối trên mơi trường thóc, nếu sử dụng pha dạng nước tưới thì mơi trường gạo hoặc ngơ khi nghiền nhỏ sẽ tạo bột mịn hơn mơi trường thóc.
Hình 3.6. Ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi đối với nấm Trichoderma
3.5.2. Nghiên cứu lượng nước trong môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma sp. Trichoderma sp.
Các loại môi trường khi sử dụng để nhân sinh khối cần phải được hấp chín
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
đảm bảo cho nấm phát triển, vì vậy cần nghiên cứu lượng nước thích hợp cho từng loại mơi trường.
3.5.2.1. Lượng nước cho môi trường gạo
Để xác định được lượng nước thích hợp cho mơi trường gạo để nhân sinh khối nấm Trichoderma sp., chúng tôi tiến hành 4 mức nước khác nhau 50 ml, 100
ml, 150 ml, 200 ml trong thí nghiệm, kết quả được thể hiện trong bảng 3.12.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm
Trichoderma sp. trên môi trường gạo
Nguồn nấm
Trichoderma
Cơng thức thí nghiệm
Chỉ tiêu theo dõi
Số bào tử/g Ngày xuất hiện bào tử (sau cấy) Tr-tv CT5 74 x 106 b 5 – 6 CT6 26 x 108 c 3 - 4 CT7 40 x 108 d 3 - 4 CT8 33 x 104 a 4 - 5 CV (%) 12,2 Tr-H CT5 72 x 106 b 5 - 6 CT6 35 x 108 c 3 - 4 CT7 44 x 108 d 3 - 4 CT8 43 x 104 a 4 - 5 CV (%) 6,4 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
CV: Độ biến động (%)
Lượng nước ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của nấm Trichoderma trên môi trường nhân sinh khối. Mức 250g gạo + 150ml (CT7) nước cho mật độ bào tử cao nhất (40 - 44 x 108 bào tử/g), sau 3 – 4 ngày nuôi cấy bào tử nấm xuất hiện, sau 7 – 10 ngày bào tử nấm mọc đều xanh kín sinh khối nhân ni, ở lượng nước gạo
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
nở vừa phải, khi lắc nhẹ vẫn có độ tơi xốp khơng bị dính. Ở mức 250g gạo + 50ml (CT5) nước cho lượng bào tử thấp (72 x 106 bào tử/g), nấm phát triển kém là do lượng nước ít, gạo không đủ độ nở, khi hấp xong rất khô. Sau cấy do nấm phát triển sợi kém, sau 5 – 6 ngày mới xuất hiện bào tử nấm trên bề mặt sinh khối nhân ni. Sau đó nấm phát triển kém dần, sinh khối nấm có màu xanh nhạt. Ở mức 250g gạo + 200ml nước (CT8), lượng nước lúc này lại quá dư thừa, gạo nở tạo độ dính, mơi trường nhân sinh khối rất bết, khơng thống khí, sợi nấm chỉ phát triển trên bề mặt, sau 4 – 5 ngày bào tử nấm xuất hiện nhưng khơng mọc lan tỏa được vào phía trong của mơi trường nhân sinh khối. Nấm không phát triển được, môi trường nhiều nước sau cấy 6 – 7 ngày bị ơi thiu, thường có mùi chua, mật độ bào tử thấp nhất (43 x 104 bào tử/g).
Hình 3.7. Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm
Trichoderma trên môi trường gạo
3.5.2.2. Lượng nước cho môi trường bột ngô
Nghiên cứu lượng nước thích hợp cho môi trường bột ngơ, tiến hành thí nghiệm với 5 mức nước khác nhau: 50 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.13.
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma sp. trên môi trường bột ngô
Nguồn nấm
Trichoderma Công thức thí nghiệm
Chỉ tiêu theo dõi
Số bào tử/g Ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)
Tr-tv CT9 119 x 106 b 5 - 6 CT10 10 x 108 d 3 - 4 CT11 18 x 108 e 3 - 4 CT12 88 x 107 c 4 – 5 CT13 40 x 104 a 5 – 6 CV (%) 10,6 Tr-H CT9 181 x 106 b 5 - 6 CT10 12 x 108 d 3 - 4 CT11 19 x 108 e 3 - 4 CT12 10 x 108 c 4 - 5 CT13 80 x 104 a 5 - 6 CV (%) 11,7 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
CV: Độ biến động (%)
Lượng nước cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng phát triển của nấm
Trichoderma trên môi trường nhân sinh khối, ở mức 250g bột ngô + 150 ml nước
(CT11), nấm phát triển tốt và cho lượng bào tử cao nhất (18 – 19 x 108 bào tử/g), ở công thức này ngô nở vừa đủ, cho độ tơi xốp, khi lắc khơng bị vón cục. Ở mức 250g bột ngô + 50ml nước (CT9), bột ngô thiếu nước cũng hạn chế sự phát triển của nấm Trichoderma, nên mật độ bào tử thấp (119 - 181 x 106 bào tử/g), ở mức 250g bột ngô + 250ml nước (CT13), lượng nước lại quá nhiều, ngô bết lại nấm
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
không mọc được, sau 5 – 6 ngày môi trường nhân sinh khối bị chua, lượng bào tử đạt thấp chỉ là 40 – 80 x 104 bào tử/g. Vì vậy đối với mơi trường bột ngơ chọn mức 250g bột ngô + 150 ml (CT11) nước để nhân sinh khối.
Hình 3.8. Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm
Trichoderma trên môi trường bột ngô
3.5.2.3. Lượng nước cho mơi trường thóc
Mơi trường thóc đã được nghiên cứu là thích hợp nhất cho nấm
Trichoderma phát triển, tuy nhiên để xác định được lượng nước thích hợp cho mơi
trường nhân ni, tiến hành thí nghiệm hấp thóc với các mức nước khác nhau, kết quả thu được ở bảng 3.14.
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm
Trichoderma trên mơi trường thóc
Nguồn nấm
Trichoderma Cơng thức thí nghiệm
Chỉ tiêu theo dõi
Số bào tử/g Ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)
Tr-tv CT14 41 x 106 a 5 – 6 CT15 10 x 108 b 4 – 5 CT16 31 x 108 c 3 – 4 CT17 53 x 108 d 3 – 4 CT18 44 x 107 a 3 – 4 CV (%) 13,6 Tr-H CT14 55 x 106 a 5 – 6 CT15 11 x 108 c 4 – 5 CT16 31 x 108 d 3 – 4 CT17 54 x 108 e 3 – 4 CT18 59 x 107 b 3 – 4 CV (%) 11,4 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
CV: Độ biến động (%)
Kết quả cho thấy mơi trường thóc u cầu lượng nước nhiều hơn so với môi trường gạo và bột ngơ. Với lượng nước ít, thóc khơ khơng nở, nấm phát triển kém, mật độ bào tử tăng theo lượng nước trong mơi trường nhân sinh khối và thích hợp nhất ở mức 200g thóc + 250ml nước (CT17), đạt mật độ bào tử cao nhất (54 x 108 bào tử/g). Nếu lượng nước vượt quá ở mức 200g thóc + 300ml nước (CT18), thóc nở nhưng nhanh chua, khi thóc bị chua cũng ức chế sự phát triển của nấm. Đối với mơi trường thóc dùng để nhân sinh khối chúng tơi khuyến cáo ở mức 200g thóc + 250ml nước (CT17).
3.5.3. Nghiên cứu xác định các thông số kỹ thuật tối ưu trong lên men nhân sinh khối của nấm Trichoderma (ánh sáng, chế độ cấp khí) nhân sinh khối của nấm Trichoderma (ánh sáng, chế độ cấp khí)
3.5.3.1. Nghiên cứu chế độ cấp khí trong lên men nhân sinh khối
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
Chế độ khí trong mơi trường nhân sinh khối có ảnh hưởng đến q trình phát
triển của nấm Trichoderma. Thí nghiệm nhân ni nấm Trichoderma trong trường hợp yếm khí được tiến hành bằng cách đậy nút nhựa kín và có đảo trộn để tạo độ tơi xốp, kết quả được thể hiện trong bảng 3.15.
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của chế độ đậy nút kín và đảo trộn đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma
Nguồn
nấm Cơng thức thí nghiệm
Chỉ tiêu
Số bào tử/g Ngày xuất hiện bào tử (sau cấy) Tr-tv CT19 33 x 104 a 5 - 6 CT20 43 x 104 a 5 - 6 CT21 96 x 104 b 5 - 6 CT22 273 x 104 c 5 - 6 CV (%) 12,9 Tr-H CT19 30 x 104 a 5 - 6 CT20 53 x 104 a 5 - 6 CT21 106 x 104 b 5 - 6 CT22 266 x 104 c 5 - 6 CV (%) 17,0 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
CV: Độ biến động (%)
Kết quả cho thấy nấm Trichoderma sp. phát triển rất kém trong điều kiện
thiếu khí, ở tất cả các cơng thức có đảo trộn để tạo độ thơng thống, nhưng khơng có sự cấp khí ở bên ngồi vào thì nấm đều phát triển kém. Mật độ bào tử chỉ đạt 105 - 106 bào tử/g. Việc đảo liên tục cũng không tốt cho sự phát triển của nấm, đảo trộn 5 ngày/1 lần cho mức bào tử đạt cao nhất (266 x 104 bào tử/g). Quá trình sản xuất nhân sinh khối nấm Trichoderma khơng khuyến cáo đậy nút kín.
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
b. Buộc nút hở và đảo trộn cấp khí
Thí nghiệm trên cho thấy nấm Trichoderma khơng phát triển thích hợp trong mơi trường yếm khí, việc cấp khí cho mơi trường lên men nhân sinh khối là rất quan trọng, tuy nhiên để xác định chế độ cấp khí thích hợp tiến hành thí nghiệm buộc nút hở và đảo trộn với các mức đảo trộn khác nhau trên mơi trường thóc, kết quả được thể hiện trong bảng 3.16.
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của chế độ buộc nút hở và đảo trộn cấp khí đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma sp.
Nguồn nấm
Cơng thức thí nghiệm
Chỉ tiêu theo dõi
Số bào tử/g Ngày xuất hiện bào tử (sau cấy) Tr-tv CT23 9 x 108 a 3 – 4 CT24 32 x 108 c 3 – 4 CT25 55 x 108 d 3 - 4 CT26 35 x 108 c 3 – 4 CT27 25 x 108 b 3 – 4 CT28 7 x 108 a 3 - 4 CV (%) 11,3 Tr-H CT23 7 x 108 a 3 – 4 CT24 34 x 108 c 3 – 4 CT25 54 x 108 d 3 – 4 CT26 37 x 108 c 3 - 4 CT27 25 x 108 b 3 – 4 CT28 7 x 108 a 3 – 4 CV (%) 7,1 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
Buộc nút hở mục đích để cấp khí cho mơi trường nhân sinh khối, tuy nhiên phía trong của mơi trường nhân sinh khối cũng phải được cấp khí bằng cách lắc đảo trộn mơi trường. Khi lắc đảo trộn, tạo độ thơng thống, giúp cho bào tử và sợi nấm lan sâu vào trong môi trường nhân sinh khối. Tuy nhiên khi đảo trộn liên tục 1 ngày/ lần cũng hạn chế sự phát triển của nấm Trichoderma, vì theo nghiên cứu thời gian hình thành bào tử của nấm Trichoderma trên môi trường PDA cho thấy phải mất 3 ngày mới xuất hiện bào tử trên môi trường, do đảo trộn liên tục sẽ cắt đứt sợi, phá vỡ quá trình hình thành bào tử nấm, bào tử nấm khơng được hình thành nhiều sẽ hạn chế sự phát tán và mọc lan trên môi trường. Ở công thức Buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí 2 lần sau 3 ngày và 10 ngày (CT25) cho mật độ bào tử đạt cao nhất (54 x 108 bào tử/g), sau 3 ngày khi bào tử được hình thành trên bề mặt của mơi trường nhân sinh khối (mặt mơi trường nhân sinh khối có màu xanh), đảo nhẹ tạo độ xốp cho môi trường và giúp cho bào tử nấm có thể phát tán đều cho tồn bộ mơi trường sinh khối, đến 10 ngày sau đảo lại lần nữa nhằm giúp cho bào tử bám đều bề mặt của thóc, phát triển đến mức tối đa sau 15 ngày ni cấy, hồn thiện chu trình nhân ni nấm trên môi trường nhân sinh khối.
3.5.3.2. Nghiên cứu chế độ ánh sáng ảnh hưởng đến khả năng phát triển của nấm trên môi trường nhân sinh khối
Để xác định được chế độ ánh sáng thích hợp cho sự phát triển của nấm
Trichoderma, thí nghiệm tiến hành chọn môi trường nhân sinh khối là mơi trường
thóc đặt ở các điều kiện ánh sáng khác nhau, theo dõi sự phát triển của nấm trên môi trường, kết quả được thể hiện trong bảng 3.17.
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma sp.
Nguồn nấm
Cơng thức thí nghiệm
Chỉ tiêu theo dõi Số bào tử/g
Ngày xuất hiện bào tử (sau cấy) Tr-tv CT29 25 x 108 a 3 - 4 CT30 54 x 108 b 3 – 4 CT31 29 x 108 a 3 - 4 CV (%) 24,2 3 - 4 Tr-H CT29 27 x 108 a 3 - 4 CT30 58 x 108 b 3 - 4 CT31 31 x 108 a 3 - 4 CV (%) 18,3 3 - 4 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
CV: Độ biến động (%)
Chế độ ánh sáng cũng khơng ảnh hưởng nhiều đến q trình phát triển của