3.3.2. Khả năng sinh kháng sinh bay hơi của nấm Trichoderma sp.
Theo Seiketov (1982), một số dòng nấm Trichoderma cịn có khả năng sinh chất kháng sinh bay hơi có khả năng tiêu diệt nấm bệnh, ngay cả khi khơng có sự tiếp xúc trực tiếp với nhau. Kết quả nghiên cứu về khả năng sinh kháng sinh bay hơi của 5 dịng nấm có khả năng đối kháng cao để tiêu diệt nấm bệnh Phytophthora
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
Bảng 3.5. Khả năng ức chế nấm Phytophthora palmivora bằng chất kháng sinh bay hơi của các dòng nấm Trichoderma sp.
TT Nguồn
Trichoderma
Phytophthora palmivora
Đường kính tản nấm sau cấy(cm)
6 ngày Hiệu quả
ức chế (%) Đối kháng Đối chứng 1 Tr-H 0,6 8,5 92,9 2 Tr-1 2,6 8,6 69,7 3 Tr-2 2,2 8,4 73,8 4 Tr-tv 1,2 8,5 85,8 5 Tr-3 1,6 8,6 81,3 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013)
Hình 3.3. Hiệu quả ức chế của giống Trichoderma đã phân lập đối với nấm Phytophthora palmivora
Kết quả cho thấy sau 2 ngày cấy truyền cả 2 loại nấm Trichoderma và
Phytophthora palmivora đều mọc trên môi trường. Sau 3 ngày nấm Trichoderma
đã mọc kín hộp ở cả cơng thức thử tính đối kháng và đối chứng, ngược lại nấm
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
mọc tiếp, công thức đối chứng vẫn tiếp tục mọc. Từ ngày thứ 6 – 8 sau khi cấy trở đi, nấm Trichoderma tiết chất kháng sinh làm sợi nấm Phytophthora palmivora teo dần và chết. Ở công thức đối chứng (khơng có nấm Trichoderma) nấm P. palmivora sinh trưởng và phát triển tốt sau 7 ngày đã đạt đường kính tối đa. Hiệu
quả ức chế của các dòng nấm Trichoderma đối với nấm Phytophthora palmivora
gây bệnh trên ca cao từ 73,8 – 92,9 %.
3.4. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh học và sinh thái của nấm
Trichoderma sp.
3.4.1. Đặc điểm hình thái của nấm Trichoderma sp. trên môi trường nhân tạo. nhân tạo.
Các nguồn nấm Trichoderma cấy trên môi trường PDA ở nhiệt độ 25 – 28oC phát triển như sau: sau khi cấy bào tử nẩy mầm tạo thành ống mầm. Ống mầm phát triển thành sợi nấm. Từ điểm tăng trưởng ban đầu (điểm cấy nấm), các sợi nấm này lan ra xung quanh tạo thành hình tia. Sợi nấm trong suốt, rất mịn, sau khi cấy 1 ngày sợi nấm bắt đầu phân nhánh, các sợi nấm không rời khỏi mặt môi trường. Những sợi nấm này gọi là sợi nấm nền. Ngày thứ 2 sau cấy, sợi nấm nền tiếp tục lan rộng, phát triển tạo thành thể sợi nấm nền. Sau đó trên bề mặt mơi trường đã hình thành những sợi nấm mọc nổi ở phía trên. Đây là những sợi nấm khí, những sợi nấm khí cụm lại với nhau tạo thành từng đám nhỏ. Trên sợi nấm khí hình thành bào tử. Nếu nhiều sợi nấm khí thì sẽ hình thành nhiều bào tử. Ngày đầu tiên mới hình thành, bào tử có màu xanh lá cây nhạt. Nhiều bào tử cụm lại tạo thành đám có màu xanh. Các đám bào tử cụm lại thành các mụn u trên thảm nấm có màu xanh lá cây rất đặc trưng. Các đám bào tử theo thời gian lan rộng dần, từng đợt tạo thành những đường tròn đồng tâm trên bề mặt môi trường, sau 4 ngày nuôi cấy nấm
Trichoderma trên mơi trường có màu xanh (hình 3.4), giai đoạn này lượng bào tử
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
Sợi nấm sau 1 ngày nuôi cấy Sợi nấm sau 2 ngày nuôi cấy
Sợi nấm sau 3 ngày nuôi cấy Sợi nấm sau 4 ngày ni cấy
Hình 3.4. Các giai đoạn phát triển sau ni cấy của nấm Trichoderma sp. trên môi trường
3.4.2. Đặc điểm sinh thái của nấm Trichoderma sp.
3.4.2.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự phát triển của nấm Trichoderma sp.
Sự sinh trưởng, phát triển của nấm Trichoderma sp. liên quan nhiều đến mơi trường. Hiện nay có rất nhiều loại mơi trường nhân tạo dùng để ni cấy các lồi nấm. Trong điều kiện phịng thí nghiệm, tiến hành tìm hiểu ảnh hưởng của một số môi trường phổ biến Czapek, CMA, PDA đến sinh trưởng, phát triển của nấm
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới sự phát triển của nấm Trichoderma sp. có triển vọng
Nguồn nấm
Môi trường nuôi cấy
Chỉ tiêu theo dõi Đường kính
sợi nấm sau 3 ngày (cm)
Ngày xuất hiện bào tử (sau cấy) Số bào tử/ml Tr-H CMA 6,8 a 3 – 4 92 x 107 a Czapek 7,7 b 2 – 3 392 x 107 b PDA 8,3 c 2 – 3 592 x 107 c CV (%) 1,0 11,4 Tr-tv CMA 6,4 a 3 – 4 81 x 107a Czapek 7,5 b 2 – 3 318 x 107 b PDA 8,0 c 2 – 3 501 x 107 c CV (%) 1,2 34 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
CV: Độ biến động (%)
Mơi trường có ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Trichoderma, trong 3
loại mơi trường thí nghiệm, mơi trường PDA thích hợp nhất cho sự phát triển của sợi nấm sau 3 ngày đường kính đạt kích thước cao nhât (8,0 – 8,3 cm), đồng thời môi trường này cũng cho lượng bào tử cao nhất (501 x 107 – 592 x 107 bào tử/ ml). Môi trường Czapek cũng khá thích hợp cho sự phát triển của nấm Trichoderma,
sau 3 ngày đường kính tán nấm đạt 7,5 – 7,7 cm, lượng bào tử sinh ra từ 318 x 107 - 392 x 107 bào tử/ ml. Mơi trường CMA khơng thích hợp cho sự phát triển của nấm
Trichoderma, sau 3 ngày ni cấy kích thước đường kính tản nấm chỉ đạt 6,4 – 6,8
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
3.4.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Trichoderma
Nhiệt độ là yếu tố sinh thái quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm Trichoderma. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của nấm Trichoderma được thể hiện trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng, phát triển của nấm Trichoderma sp. có triển vọng
Nguồn nấm
Điều kiện nhiệt độ
(0C)
Chỉ tiêu theo dõi Đường kính sợi nấm sau 3 ngày (cm) Ngày xuất hiện bào tử (sau cấy) Số bào tử/ml Tr-H 15 3,9 a 5 - 6 81 x 107 a 20 5,8 b 4 - 5 17 x 108 b 25 7,4 d 3 - 4 48 x 108 d 30 8,5 e 2 - 3 41 x 108 c 35 7,0 c 4 - 5 18 x 108 b CV (%) 1,7 7,1 Tr-tv 15 3,7 a 5 - 6 72 x 107 a 20 5,7 b 4 - 5 16 x 108 b 25 7,0 d 3 - 4 41 x 108 d 30 8,1 e 2 - 3 34 x 108 c 35 6,8 c 4 - 5 17 x 108 b CV (%) 1,8 5,0 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
CV: Độ biến động (%)
Kết quả cho thấy phạm vi nhiệt độ cho cả 2 dòng nấm Trichoderma sp. sinh trưởng, phát triển tương đối rộng từ 15 - 350C. Tuy nhiên ở nhiệt độ thấp (15 - 200C) nấm Trichoderma sinh trưởng, phát triển chậm và hình thành bào tử ít. Tốc
độ sinh trưởng chỉ đạt 1,4 – 2,0 cm/ngày đêm, sau 3 ngày đường kính tản nấm chỉ đạt 3,7 – 5,8 cm, phải sau 5- 6 ngày cấy nấm mới có bào tử xuất hiện. Nhiệt độ từ 25 - 300C thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Trichoderma, tốc độ
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
tăng trưởng nấm nhanh đạt 2,3 – 2,9 cm/ngày đêm, sau 3 ngày đường kính tản nấm đạt 7,4 – 8,5 cm. Lượng bào tử sinh ra với mật độ cao nhất (34 x 108 - 48 x 108 bào tử/ ml), sau 2 – 3 ngày đã xuất hiện bào tử. Nhiệt độ 350C nấm sinh trưởng và phát triển chậm hơn.
3.4.2.3. Ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng đến sự phát triển của nấm Trichoderma sp.
Thí nghiệm tiến hành nuối cấy nấm Trichoderma ở 3 điều kiện chiếu sang khác nhau, sáng xen tối (12 tiếng sáng và 12 tiếng tối), sáng liên tục, tối liên tục. Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sinh trưởng và phát triển của nấm Trichoderma sp. có triển vọng
Nguồn nấm
Chế độ ánh sáng
Sự phát triển sợi Ngày xuất hiện bào tử (sau cấy) Số bào tử/ml Tốc độ tăng trưởng (cm/ngày) Đường kính sau 3 ngày (cm) Tr-H Tối liên tục 2,2 6,6 a 3 - 4 25 x 108 a Sáng liên tục 2,6 7,9 c 2 - 3 28 x 108 a 12 tiếng sáng và 12 tiếng tối 2,5 7,4 b 3 - 4 36 x 10 8 b CV (%) 1,9 8,0 Tr-tv Tối liên tục 2,1 6,4 a 3 - 4 24 x 108 a Sáng liên tục 2,5 7,6 c 2 - 3 29 x 108 b 12 tiếng sáng và 12 tiếng tối 2,3 7,0 b 3 - 4 32 x 10 8 c CV (%) 2,0 5,7 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
CV: Độ biến động (%)
Kết quả trên cho thấy ánh sáng có ảnh hưởng tới tốc độ tăng trưởng của nấm. Công thức sáng xen tối (12 tiếng sáng + 12 tiếng tối) chỉ sau 3 ngày cấy nấm đã có sợi nấm hình thành nhiều với mật độ dày, đường kính vùng sợi nấm lan rộng,
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
số lượng bào tử đạt cao nhất (32 x 108 - 36 x 108 bào tử/ml), nhiều hơn so với sáng liên tục và tối liên tục. Ở công thức chiếu sáng liên tục, sợi nấm phát triển chiều dài nhưng mật độ sợi nấm lại thưa và số lượng bào tử ít hơn so với điều kiện tối xen sáng. Ở công thức tối liên tục, sợi nấm lan chậm, sợi mọc tới đâu bào tử hình thành từng đợt rất rõ. Như vậy điều kiện ánh sáng xen tối là thuận lợi nhất cho nấm
Trichoderma sinh trưởng và phát triển.
3.4.2.4. Ảnh hưởng của độ pH đến sự phát triển của nấm Trichoderma sp.
Sự phát triển và sinh trưởng của các loài vi sinh vật phụ thuộc rất nhiều vào pH của môi trường, cụ thể nấm Trichoderma sinh trưởng, phát triển và tồn tại trong đất, nên pH đất sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của lồi nấm này. Nấm Trichoderma được ni cấy trong môi trường tại 4 mức pH, pH =4, 5, 6 và 7. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Trichoderma sp có triển vọng Nguồn nấm Giá trị pH Tốc độ tăng trưởng của nấm/ngày đêm
(cm) Đường kính sau 3 ngày (cm) Ngày xuất hiện bào tử Số bào tử/ml Tr-H 4 0,4 1,1 a 0 0 5 2,7 8,3 c 3 25 x 108 6 2,9 8,7 d 3 36 x 108 7 2,3 7,0 b 3 16 x 108 CV (%) 1,6 Tr-tv 4 0,4 0,9 a 0 0 5 2,6 8,0 c 3 24 x 108 6 2,8 8,5 d 3 34 x 108 7 2,3 6,8 b 3 14 x 108 CV (%) 1,3 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
CV: Độ biến động (%)
Nấm Trichoderma đều phát triển được ở 4 mức pH khác nhau, tuy nhiên tốc độ phát triển có khác nhau. Ở Mức pH thấp (pH=4) nấm sinh trưởng và phát triển
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
rất kém, tốc độ tăng trưởng của nấm chỉ đạt 0,4 cm/ngày đêm, đặc biệt ở độ pH này nấm khơng có khả năng hình thành bào tử. Ở pH=5 và 6 tốc độ sinh trưởng sợi nấm đạt 2,6 – 2,9cm/ngày đêm, lượng bào tử từ 24 – 36 x 108/ml. Mức pH=7 tốc độ phát triển của nấm cũng giảm đi đạt 2,3 cm/ngày đếm và lượng bào tử đạt 14 – 16 x 108/ml. Từ kết quả trên cho chúng tôi thấy, khi sử dụng chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma ở những vùng đất chua thì hiệu quả sẽ
bị hạn chế thậm chí phản tác dụng.
3.4.2.5. Định tính hoạt độ enzym chitinase, β-glucanase và cellulase của nấm Trichoderma
Năm dòng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm
Phytophthora palmivora cao nhất được lựa chọn để định tính hoạt độ của một
số enzyme có khả năng phân giải tế bào của các loài nấm gây bệnh. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.10.
Bảng 3.10. Định tính hoạt độ enzyme của nấm đối kháng
Trichoderma sp có triển vọng
TT Nguồn nấm
Trichoderma
Đường kính vịng phân giải (cm) Cellulase Chitinase β-Glucanase
1 Tr-H 4,8 d 4,6 c 4,8 d 2 Tr-1 4,3 c 3,2 b 4,3 c 3 Tr-2 4,3 c 3,2 b 4,3 c 4 Tr-3 4,1 b 3,9 bc 4,1 b 5 Tr-tv 4,8 d 4,7 c 4,7 d CV (%) 2,0 1,5 2,3 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
CV: Độ biến động (%)
Kết quả cho thấy cả 5 nguồn nấm Trichoderma sp. đều cho vòng phân giải cao khi định tính các enzyme Cellulase, Chitinase, β-Glucanase trên mơi trường, trong đó nguồn Tr-H và Tr-tv có vịng phân giải cao nhất: 4,6 - 4,8 cm, tương ứng 2 nguồn này có hoạt độ enzyme Cellulase, Chitinase, β-Glucanase cao nhất. Các dòng khác cho đường kính vịng phân giải thấp hơn, đạt từ 3,2 - 4,3 cm.
Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19
Theo Jollès và Muzzarelli, 1999, các loài nấm mốc như Trichoderma sp. cho hàm lượng chitinase cao. Chitinase giữ vai trò chính trong hoạt động ký sinh của các loài nấm này với các loài nấm gây bệnh cho cây trồng. Nấm Trichoderma sp. khi ký sinh nấm gây bệnh sẽ tiết ra hệ enzyme phân hủy chitin của vách tế bào nấm gây bệnh bao gồm 6 enzyme: 2 enzyme -1,4-N-acetylglucosaminidase và 4 enzyme endochitinase. Các chủng nấm mốc Trichoderma có khả năng sản sinh - glucanase cao. -glucanase của Trichoderma giữ vai trị chính trong hoạt động ký
sinh để đối kháng nấm gây bệnh cây trồng. -1,3-glucanase ở Trichoderma kìm
hãm quá trình sinh tổng hợp -1,3-glucan vách tế bào, ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh.