Chủng vi sinh vật: 38 chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ sữa trong bộ sưu
tập giống tại Viện Công nghiệp Thực phẩm được lựa chọn để khảo sát các đặc điểm của chủng giống khởi động cho sản xuất pho mát.
Nguồn sữa: Sữa được dùng để lên men là loại sữa tươi thanh trùng Mộc Châu
khơng đường có hàm lượng (tính trên 100ml): Chất béo 3,5g ± 0,3; Protein 3,1g ± 0,1; Canxi 115mg ± 11. 2.3. Môi trường 2.2.1. Môi trường MRS Thành phần Hàm lượng (%) Glucose 2 Pepton 1 Cao nấm men 1,5 MgSO4.7H2O 0,02 MnSO4.H2O 0,005 Sodium acetate 0,5 K2HPO4.3H2O 0,26 Tween 80 0,1 Triamonium citrate 0,215 pH : 6,5-6,8
- Mơi trường MRS – agar có bổ sung thêm agar 2% và 0,3% CaCO3. - Môi trường được hấp vô trùng 1210C trong 15 phút.
2.2.2. Môi trường thử citrate Thành phần môi trường M: Thành phần môi trường M: Thành phần Hàm lượng (g/L) Sữa gầy 10g Peptone 2,5g Glucose 5g Agar 20g pH: 6,6
- Dung dịch A: Potasium ferry cyanide 10%.
Hấp tiệt trùng môi trường M, dung dịch A, B ở 115oC/ 15 phút. Sau khi hấp vô trùng, thêm 10 ml mỗi dung dịch A, B vào 1 lít mơi trường M.
2.2.3. Mơi trường thử hoạt tính protease ngoại bào
Thành phần mơi trường casein - agar:
Thành phần Hàm lượng, g/L
Casein 8
Agar 20
Cân 8g casein pha trong 500 ml nước, gia nhiệt và khuấy nhẹ đến 80oC, lọc bỏ cặn bằng giấy lọc. Định mức đến 1000mL, thêm 20g agar, đun sôi và tiệt trùng ở 121oC/15 phút. Khi nhiệt độ xuống đến 70 – 80oC, đổ đĩa petri, phơi khô và cất vào nơi quy định.
2.2.4. Môi trường thử khả năng đông tụ sữa Thành phần môi trường litmus – lactose Thành phần môi trường litmus – lactose
Thành phần Hàm lượng/ lít
Sữa gầy 100g
litmus 70 ml
pH: 6,8
Cân 100g sữa gầy, pha trong 500 ml nước ấm 37 – 40oC. Bổ sung thêm 70ml litmus. Định mức tới 1 lít. Môi trường được phân phối vào các ống nghiệm 10ml/ống. Hấp vô trùng 110oC/ 20 phút.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp kiểm tra khả năng đông tụ sữa
Phương pháp này dựa vào khả năng lên men lactose tạo axit lactic của chủng vi khuẩn, giảm pH môi trường xuống 4,2 – 4,5 (là điểm đẳng điện của casein), làm đông tụ sữa và chuyển môi trường từ tím sang màu hồng. Thực hiện theo mơ tả của Washington C. Winn và cộng sự (2006) [75].
Lấy 1 vòng que cấy khuẩn lạc của mỗi chủng từ đĩa MRS – agar đã nuôi 48 giờ, hoạt hóa vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường litmus – lactose và nuôi ở 30oC. Theo dõi màu sắc và hiện tượng đông tụ sữa sau mỗi 24 giờ. Các ống nghiệm đơng tụ có màu trắng và hồng nhạt là kết quả của quá trình lên men lactose, phân
giải casein, litmus. Sau 7 ngày, ống nghiệm vẫn ở dạng lỏng, có màu tím của litmus thì chủng lactic khơng làm đông tụ sữa.
2.4.2. Phương pháp xác định kiểu len men
Nguyên lý của phương pháp là khả năng sinh khí CO2 của các chủng lên men lactic dị hình làm xuất hiện bọt khí trong ống Durham.
Các chủng latic được cấy chuyển sang ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MRS lỏng và ống Durham úp ngược, nuôi ở các nhiệt độ thích hợp trong 24h và quan sát. Nếu thấy nổi bọt trong ống Durham, chứng tỏ chủng có sinh CO2 (chủng lên men lactic dị hình). Khơng thấy bọt khí trong ống Durham – chủng lên men lactic đồng hình.
2.4.3. Phương pháp kiểm tra phổ nhiệt độ sinh trưởng
Chủng lactic được cấy ria trên đĩa MRS – agar, nuôi ở dải nhiệt độ: 15, 20, 30, 37, 40,42, 45 (oC). Nếu trên đường cấy ria, thấy khuẩn lạc mọc dày thì chứng tỏ chủng sinh trưởng tốt, kí hiệu (+); xuất hiện khuẩn lạc nhưng khuẩn lạc nhỏ, lớp sinh khối mỏng là chủng có khả năng sinh trưởng yếu, kí hiệu (-/+). Khơng thấy khuẩn lạc tức là chủng không phát triển được, kí hiệu (-).
2.4.4. Phương pháp kiểm tra khả năng sử dụng citrate
Phương pháp này dựa trên phản ứng giữa ion Fe3+, giải phóng từ hợp chất ferric citrate ở những chủng sử dụng được citrate, và potasium ferrycyanide tạo ra phức chất có màu xanh prussian. Thực hiện theo mô tả của Kempler và cộng sự (1980) [43].
Chủng vi khuẩn lactic được cấy ria trên đĩa MRS – agar, ni ở nhiệt độ thích hợp trong 48 giờ. Khuẩn lạc của mỗi chủng được cấy ria sang đĩa chứa môi trường citrate. Sau 48 giờ, kiểm tra trên đĩa thạch: chủng nào có xuất hiện màu xanh prussian chứng tỏ có khả năng sử dụng citrate, chủng nào không làm xuất hiện màu xanh prussian, khơng chuyển hóa được citrate.
2.4.5. Phương pháp định lượng exopolysaccharide
Phương pháp này dựa trên khả năng không tan trong ethanol và tan trong nước nóng của exopolysaccharide. Lượng EPS thu được sẽ được định lượng theo phương
pháp phân tích đường tổng phenol - axit sunfuric, sử dụng glucose là chất chuẩn. Tiến hành theo mô tả của Pablo Sebastián RIMADA và cộng sự (2003) [56]:
Chủng vi khuẩn, được hoạt hóa hai lần trong ống nghiệm chứa 5 ml môi trường MRS, nuôi ở 30oC (chủng ưa ấm) và 37oC (chủng ưa nhiệt)/ 18 giờ. Sau đó, 5ml dịch ni cấy được ly tâm 8000 vòng/ phút trong 10 phút ở 30oC. Sinh khối thu được, dùng để lên men 50 ml sữa thanh trùng Mộc Châu đã được hấp tiệt trùng 110oC/ 20 phút. Mẫu đối chứng không bổ sung vi sinh vật. Sau đông tụ, dịch sữa lên men và mẫu đối chứng đã chỉnh pH xuống 4,3 bằng HCl 10%, được phá đông tụ và đun cách thủy 15 phút. Ly tâm lần 1: 10000 vòng/ phút trong 15 phút, thu dịch trong. Hút 10 ml dịch trên sang ống fancol, bổ sung 20 ml cồn lạnh và để ở -20oC/ 20 – 24 giờ, làm kết tủa EPS. Ly tâm lần 2, 8000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC, thu kết tủa. Hòa tan phần kết tủa thu được trong 10 ml nước nóng (> 95oC) và để nguội. Bổ sung 20 ml cồn lạnh, để -20oC/ 20 – 24 giờ. Ly tâm lần 3, 8000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC, thu kết tủa. Kết tủa được hòa tan với 10 ml nước nóng. Tiến hành ly tâm lần 4, 8000 vòng/ phút trong 10 phút ở 30oC, thu dịch trong. Dịch này dùng để xác định hàm lượng EPS trong dịch sữa lên men, được bảo quản ở -20oC cho tới khi phân tích.
2.4.6. Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng số phenol - axit sunfuric Axit H2SO4 đặc có tác dụng phân cắt đường có phân tử lớn thành đường Axit H2SO4 đặc có tác dụng phân cắt đường có phân tử lớn thành đường glucose. Phân tử glucose tạo phức với phenol 5% lập thành màu. So màu trên bước sóng λ = 490nm ta xác định được đường tổng trong mẫu phân tích. Thực hiện theo mơ tả của Dubois M. và cộng sự (1956) [24].
Tiến hành
Dung dịch đường chuẩn glucose có dải nồng độ: 5mg/l, 10mg/l, 20mg/l, 40mg/l, 60mg/l, 80mg/l, 100mg/l, 120mg/l.
Hút 0,5ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm, thêm vào 0,5ml dung dịch phenol 5% và lắc đều bằng máy voltex. Sau đó bổ sung 2,5ml dung dịch H2SO4 đặc (98%) và lắc đều, để nguội ở nhiệt độ phòng và đo ở bước sóng λ = 490nm. Lập đường chuẩn với glucose có dải nồng độ như trên và định lượng mẫu theo đường chuẩn.
Dựa vào giá trị OD thu được ta lập đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa glucose và mật độ quang tại bước sóng λ = 490nm. Ta dựng được đường cong chuẩn glucose là một đường thẳng có phương trình dạng:
y = ax + b Trong đó: X: giá trị mật độ quang (OD).
Y: hàm lượng đường tổng có trong mẫu (mg/l).
Dựa vào đường cong chuẩn glucose để xác định hàm lượng đường tổng (hay EPS) có trong mẫu phân tích.
2.4.7. Phương pháp kiểm tra hoạt tính enzym protease ngoại bào
Enym phân giải protein có mặt trong dịch ngoại bào thu được sau khi ly tâm, sẽ phân giải casein trên đĩa thạch chứa 2 thành phần casein – agar tạo ra vòng trong suốt sau khi đổ axit tricloroacetic 10% lên bề mặt đĩa thạch. Thực hiện theo mô tả của Nippunpreet Kaur (2013) [55], có cải biến.
Tiến hành
Để kiểm tra hoạt tính protease ngoại bào, chủng vi khuẩn lactic được nuôi trên môi trường MRS. Sau 24h, dịch nuôi cấy được ly tâm 8000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC. Thu dịch trong phía trên. Phân phối 20 µl dịch ngoại bào vào các giếng (có đường kính 6mm) trên đĩa casein – agar, để 30oC/ 24 giờ. Đối chứng (-) thay bằng 20 µl nước cất vơ trùng, đối chứng (+) thay bằng 20 µl dịch enzym neutrase. Sau 24 giờ, đổ axit tricloroacetic 10% vào các đĩa trên. Quan sát và đo đường kính vịng phân giải casein (là vịng khơng tạo màu trắng đục).
2.4.8. Xác định hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp DPPH
Phương pháp được thực hiện theo mô tả của Gayathri Balakrishnam và Ren Agrawal (2014) [32], có cải biến.
Hoạt tính chống oxy hóa được xác định dựa trên khả năng đánh bắt các gốc tự do. 2,2 – diphenyl – 1 – picrylhydrazyl (DPPH) có màu đỏ, hấp thụ cực đại ở bước sóng 517 nm, khi phản ứng với các chất chống oxy hóa có trong dịch sữa lên men, sẽ chuyển thành diphenylpicrylhydrazine có màu vàng. Dựa vào mức độ loại bỏ gốc DPPH, có thể xác định được hoạt tính chống oxy của mẫu nghiên cứu.
Chuẩn bị dịch chiết sữa lên men
Mẫu sữa đông tụ bởi chủng vi khuẩn lactic và mẫu đối chứng (không bổ sung vi sinh vật, đã chỉnh pH xuống 4,3 bằng HCl 10%) được ly tâm 10000 vòng/ phút trong 20 phút ở 4oC và thu dịch trong. Hút 2 ml dịch trên vào ống fancol, bổ sung thêm 8 ml methanol, lắc đều. Ly tâm 8000 vòng/ phút trong 5 phút, 4oC để loại bỏ kết tủa. Dịch trong phía trên được dùng để phân tích hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp DPPH.
Tiến hành
- Pha dung dịch DPPH nồng độ 0,1 mM trong methanol.
Để xác định hiệu suất loại bỏ gốc tự do, dịch mẫu, dung dịch DPPH và mẫu đối chứng (hỗn hợp nước cất : methanol tỷ lệ 1: 4) được bố trí như sau:
+ Hỗn hợp 1: 2 ml dịch mẫu và 2 ml DPPH. + Hỗn hợp 2: 2 ml dịch mẫu và 2 ml methanol. + Hỗn hợp 3: 2 ml mẫu đối chứng và 2 ml DPPH.
Mẫu đối chứng gồm . Để ở nhiệt độ phịng, trong bóng tối. Sau 30 phút, đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm.
Hiệu suất loại bỏ gốc DPPH được tính theo cơng thức sau: H (%) = [(OD3- (OD1 – OD2))/OD3]*100
Trong đó: OD1, OD2, OD3 là giá trị mật độ quang đo được tương ứng với các hỗn hợp 1, 2 và 3.
2.4.9. Phương pháp xác định hoạt tính X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase Phương pháp này thực hiện theo MAGBOUL và cộng sự (2000) [50], có cải Phương pháp này thực hiện theo MAGBOUL và cộng sự (2000) [50], có cải biến. Phương pháp dựa trên hoạt động của enzym PepX, giải phóng ra p – nitroaniline (pNA) từ cơ chất Glycyl – prolyl – 4 – nitroanilide (Gly – Pro – pNA). Lượng pNA giải phóng ra quy định hoạt tính của enzym PepX. Các bước tiến hành như sau:
Chuẩn bị dịch chiết enzym nội bào
Chủng vi khuẩn được nuôi trong 200 ml môi trường MRS ở 30oC với các chủng ưa ấm và 37oC với các chủng ưa nhiệt trong thời gian 20 giờ. Tiến hành ly
tâm thu sinh khối 8000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC. Sinh khối được rửa 2 lần bằng 50 ml nước muối 0,85%, pH 7. Sinh khối thu được bằng cách ly 8000 vòng/ phút trong 15 phút, ở 4oC. Sau rửa, sinh khối được tái huyền phù trong 20 ml đệm Tris HCl 0,05 M, pH 7,4 vơ trùng (thể tích đệm Tris HCl bằng 1/10 thể tích dịch ni cấy). Tiến hành phá tế bào bằng máy French press, áp lực 2100 psi. Điều chỉnh van đóng/mở sao cho dịch chảy ra không quá 15 giọt/phút. Sau khi phá tế bào, dịch được ly tâm 8000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC. Thu dịch trong, phân phối vào các ống eppendoff vô trùng, và bảo quản ở tủ đá (- 20oC) cho đến khi phân tích.
Kiểm tra sơ bộ hoạt tính PepX
Phân phối 50 µl cơ chất Glycyl – prolyl – p – nitroanilide (Gly – Pro – pNA) 2,0 mM vào các giếng trên đĩa Elisa. Bổ sung 50 µl dịch chiết nội bào của mỗi chủng vào mỗi giếng đã có cơ chất. Đối chứng (-): Thay dịch chiết nội bào bằng 50 ul đệm Tris HCl vô trùng. Đối chứng (+): 50 ul dịch chiết nội bào của chủng PK2 (chủng đã biết có hoạt tính PepX). Hỗn hợp để ở tủ 37oC và quan sát màu sau 5, 15, 30, 60, 90, 120 phút. Nếu có xuất hiện màu vàng sẽ được ghi nhận là có hoạt tính enzyme (+). Sau 120 phút nếu không xuất hiện màu vàng sẽ ghi nhận là khơng có hoạt tính (-).
Xác định hoạt tính PepX
- Dung dịch đường chuẩn pNA có dải nồng độ: 0,01; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 mM.
- Để xác định nồng độ pNA giải phóng ra, tiến hành bố trí thí nghiệm như sau: OD1: 50 µl dịch cơ chất + 50 µl dịch nội bào.
OD2: 50 µl dịch cơ chất + 50 µl đệm Tris HCl. OD3: 50 µl dịch nội bào + 50 µl đệm Tris HCl.
Hỗn hợp được để ở 37oC. Khi nào xuất hiện màu vàng (căn cứ theo thời gian ở bước kiểm tra sơ bộ), thì tiến hành đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 405 nm.
Mật độ quang của pNA giải phóng ra được tính theo cơng thức sau: OD (pNA) = OD1 – OD2 – OD3.
Lượng pNA được tính căn cứ vào đường chuẩn và giá trị OD (pNA). Một đơn vị hoạt độ PepX (U) được xác định bằng lượng enzym cần thiết để giải phóng 1
nanomol p – nitroaniline sau 1 phút trong điều kiện phản ứng. Hoạt độ riêng của PepX được xác định bằng đơn vị (U)/mg protein.
2.4.10. Định lượng protein bằng phương pháp Lowry
Phương pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng – protein khử hỗn hợp photphomolipden với photphovonphramat (thuốc thử folin ciocalteu) tạo phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng λ = 660nm. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
Hoá chất
Dung dịch protein chuẩn : dung dịch Bovine serum albumin (BSA) Dung dịch 1: Dung dịch Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N
Dung dịch 2: Dung dịch CuSO4 1%
Dung dịch 3:Dung dịch muối seignett 2% (C4H4KNaO6)
Dung dịch 4: Dung dịch folin chuẩn được pha với nước cất theo tỷ lệ 1 :1 Pha dung dịch mix : dung dịch mix là hỗn hợp của dung dịch 1, dung dịch 2 và dung dịch 3 theo tỷ lệ 100 :1 :1.
Tiến hành
Dựng đường chuẩn BSA theo các dải nồng độ khác nhau từ 0 – 1,0 g/l. Các mẫu đem xác định hàm lượng protein cũng được pha loãng theo các dải nồng độ sao cho giá trị OD nằm trong khoảng giữa của đường chuẩn BSA.
Hút 4ml dung dịch mix vào mỗi ống eppendorf, sau đó bổ sung thêm 0,4 ml dung dịch protein vào ống, vortex và để trong tủ 30oC trong thời gian 10 phút. Sau 10 phút ta thực hiện bổ sung thêm 0,4ml dung dịch 4 (dung dịch folin), lắc đều và để trong tủ 30oC trong thời gian 30 phút. Kết thúc phản ứng ta thực hiện đo OD ở bước sóng λ = 660nm.
Dựa vào giá trị OD thu được ta lập đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa BSA và mật độ quang tại bước sóng λ = 660nm. Ta dựng được đường cong chuẩn BSA là một đường thẳng có phương trình dạng:
Trong đó: X: giá trị mật độ quang (OD).
Y: hàm lượng protein có trong mẫu (mg/ml).
Dựa vào đường cong chuẩn BSA để xác định hàm lượng protein có trong mẫu. 2.4.11. Phương pháp kiểm tra khả năng sử dụng nguồn cacbon
Phương pháp sử dụng bromocresol purple là chất chỉ thị pH. Khi chủng lactic sử dụng được đường như là nguồn năng lượng sẽ làm giảm pH dịch nuôi cấy. Trong môi trường axit, bromocresol purple sẽ chuyển từ màu tím sang màu vàng. 49 loại đường được thử khả năng sử dụng của chủng lactic là:
Bảng 2.1: Các nguồn cacbon của bộ kit API 50 CHL
STT Đường STT Đường 0 Control 25 Esculin 1 Glycerol 26 Salicin 2 Erythritol 27 Cellobiose 3 D- Arabinose 28 Maltose 4 L- Arabinose 29 Lactose