2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.6. Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng số pheno l axit sunfuric
Axit H2SO4 đặc có tác dụng phân cắt đường có phân tử lớn thành đường glucose. Phân tử glucose tạo phức với phenol 5% lập thành màu. So màu trên bước sóng λ = 490nm ta xác định được đường tổng trong mẫu phân tích. Thực hiện theo mô tả của Dubois M. và cộng sự (1956) [24].
Tiến hành
Dung dịch đường chuẩn glucose có dải nồng độ: 5mg/l, 10mg/l, 20mg/l, 40mg/l, 60mg/l, 80mg/l, 100mg/l, 120mg/l.
Hút 0,5ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm, thêm vào 0,5ml dung dịch phenol 5% và lắc đều bằng máy voltex. Sau đó bổ sung 2,5ml dung dịch H2SO4 đặc (98%) và lắc đều, để nguội ở nhiệt độ phòng và đo ở bước sóng λ = 490nm. Lập đường chuẩn với glucose có dải nồng độ như trên và định lượng mẫu theo đường chuẩn.
Dựa vào giá trị OD thu được ta lập đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa glucose và mật độ quang tại bước sóng λ = 490nm. Ta dựng được đường cong chuẩn glucose là một đường thẳng có phương trình dạng:
y = ax + b Trong đó: X: giá trị mật độ quang (OD).
Y: hàm lượng đường tổng có trong mẫu (mg/l).
Dựa vào đường cong chuẩn glucose để xác định hàm lượng đường tổng (hay EPS) có trong mẫu phân tích.
2.4.7. Phương pháp kiểm tra hoạt tính enzym protease ngoại bào
Enym phân giải protein có mặt trong dịch ngoại bào thu được sau khi ly tâm, sẽ phân giải casein trên đĩa thạch chứa 2 thành phần casein – agar tạo ra vòng trong suốt sau khi đổ axit tricloroacetic 10% lên bề mặt đĩa thạch. Thực hiện theo mô tả của Nippunpreet Kaur (2013) [55], có cải biến.
Tiến hành
Để kiểm tra hoạt tính protease ngoại bào, chủng vi khuẩn lactic được nuôi trên môi trường MRS. Sau 24h, dịch nuôi cấy được ly tâm 8000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC. Thu dịch trong phía trên. Phân phối 20 µl dịch ngoại bào vào các giếng (có đường kính 6mm) trên đĩa casein – agar, để 30oC/ 24 giờ. Đối chứng (-) thay bằng 20 µl nước cất vơ trùng, đối chứng (+) thay bằng 20 µl dịch enzym neutrase. Sau 24 giờ, đổ axit tricloroacetic 10% vào các đĩa trên. Quan sát và đo đường kính vịng phân giải casein (là vịng khơng tạo màu trắng đục).