+ Phân tách phần chiết diclomethan bằng sắc ký cột
Lấy 10.0g phần chiết diclometan (DS) và tẩm 15.0g silicagel. Cột sắc ký
25mm được nhồi với 150 g silicagel (cỡ hạt 63-100 µm, Merck) bằng phương pháp nhồi ướt và đợi đến khi cột đã ổn định thì đưa mẫu lên cột. Tiến hành rửa giải gradient với các hệ dung môi khác nhau, bắt đầu từ hệ dung môi n-hexan/ etylacetate (9/1, v/v) và tăng độ phân cực của hệ dung môi. Qua triển khai phân tách bằng sắc ký cột thường đã phân tách được 45 phân đoạn, mỗi phân đoạn lấy 20 ml. Chấm bản mỏng và gom các phân đoạn giống nhau, thu được 5 nhóm phân đoạn, ký hiệu từ DS1 đến DS5. Sau khi cất loại hồn tồn dung mơi của 5 nhóm phân đoạn ở nhiệt độ phòng; tiếp tục phân tách phân đoạn DS1 trên sắc ký cột thường với hệ dung môi n-hexan/ etylacetate (19/1, v/v) thu được 60 phân đoạn (15ml/phân đoạn), khảo sát trên TLC để gom các nhóm phân đoạn giống nhau, thu được 5 nhóm phân đoạn; ở phân đoạn DS1.2 có xuất hiện
các tinh thể bám lên thành ống nghiệm, thu tinh thể này vào ống eppendorf, ký hiệu tinh thể thu được là DS-tt. Q trình phân tách dịch chiết và các nhóm phân đoạn của cặn chiết DS được tóm tắt trong sơ đồ hình 2.2.
Hình 2.2: Sơ đồ phân tách các phân đoạn dịch chiết diclometan
+ Phân tách phần chiết etyl acetat (ký hiệu ES)
Cân 12.2 g phần chiết etyl acetat, tẩm 20 g silicagel vào mẫu. Chuẩn bị cột sắc ký có đường kính trong 25mm, chuyển 150g silicagel (cỡ hạt 63-100 µm, Merck) vào cột bằng phương pháp nhồi ướt và đợi cho đến khi cột đã ổn định thì đưa mẫu lên cột. Tiến hành rửa giải gradient với hệ dung môi n-hexan/ etylacetate/ acetic acid (10/1/1,
v/v/v) và tăng dần độ phân cực của dung môi. Qua triển khai phân tách bằng sắc ký cột thường đã phân tách được 60 phân đoạn, mỗi phân đoạn lấy 30 ml.Gồm các phân đoạn giống nhau trên sắc ký lớp mỏng thu được 4 nhóm phân đoạn, ký hiệu từ ES1 đến ES4. Làm bay hơi hồn tồn dung mơi ở các phân đoạn ở nhiệt độ phòng. Tiếp tục phân tách phân đoạn ES3trên sắc ký cột với hệ dung môi n-hexan/aceton 19:1 (v:v) thu được 90 phân đoạn (15ml/phân đoạn), gom các phân đoạn giống nhau trên TLC, thu được 7 nhóm phân đoạn, kí hiệu là ES 3.1 đến ES 3.7, ở nhóm phân đoạn ES 3.1 có xuất hiện các tinh thể hình kim màu trắng bám lên thành ống nghiệm, chúng tơi có thu các tinh thể này vào ống eppendorf, ký hiệu tinh thể thu được là ES-tt. Q trình phân tách dịch chiết và các nhóm phân đoạn của cặn chiết DS được tóm tắt trong sơ đồ hình 2.3.