+ Xác định tổng hàm lượng phenolic
Xác định tổng lượng phenolic bằng phương pháp phân tích với thuốc thử Folin- Ciocalteux. Lấy chính xác 1 mL dịch chiết hoặc dung dịch chuẩn của acid galic (nồng độ 60, 80, 100, 120 và 140 mg/L) vào bình định mức 25 mL đã có sẵn 9 ml nước cất. Thêm 1 mL thuốc thử Folin-Ciocalteux lắc đều. Sau 5 phút, đổ 10 ml dung dịch Na2CO3 7% vào hỗn hợp. Định mức bằng nước cất. Bình định mức được giữ ở nhiệt độ
phòng 90 phút. Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 750 nm. Tổng lượng phenolic được tính bằng mg acid galic (GAE)/100 g khối lượng khô [20].
+ Xác định tổng hàm lượng flavonoid
Lấy chính xác 1ml dịch chiết (nồng độ 60, 80, 100, 120, 140 mg/l) vào bình
định mức có chứa 4 mL nước cất. Thêm 0,3 ml dung dịch NaNO2 5%. Sau 5 phút, đổ
chính xác 0,3 ml dung dịch AlCl310%. Ở phút thứ 6, thêm 2 ml dung dịch NaOH 1M. Định mức bằng nước cất. Lắc đều và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 510 nm. Tổng lượng flavonoid được xác định bằng số mg quercetin/100 g khối lượng khô [20].
+ Khảo sát khả năng bắt gốc tự do DPPH:
Nguyên tắc: 1,1- Diphenyl- 2- picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do ổn định, không tự kết hợp để tạo thành nhị phân tử. Gốc tự do có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đơi.Chất có tác dụng chống oxi hóa sẽ làm giảm màu của DPPH từ tím sang vàng nhạt khi gốc tự do bị “thu gom” bởi các chất chống oxi hóa thơng qua việc nhường nguyên tử hydro để tạo thành dạng DPPH-H bền. Hoạt tính bắt gốc tự do của chất nguyên cứu tỉ lệ thuận với độ mất màu của DPPH, xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 517nm -là cực đại hấp thụ sóng dài của phân tử DPPH.
Chuẩn bị dung dịch DPPH: pha dung dịch DPPH 0,2 mM trong methanol. Mẫu thử: Dịch chiết n-hexan, diclometan, etylacetate của cây bán chi liên. Hòa tan dịch chiết bằng methanol với các nồng độ pha loãng liên tiếp: 0.03 mg/ml; 0,06 mg/ml; 0,125 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml và 1,0 mg/ml.
Tiến hành thí nghiệm:
Lấy 4ml mẫu thử đã chuẩn bị ở trên cho vào các ống nghiệm, sau đó thêm 1ml dung dịch DPPH vào từng ống nghiệm, lắc đều. Mẫu trắng gồm 4ml ethanol và 1ml DPPH. Để yên các mẫu trong bóng tối trong 30 phút, tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 517 nm.
Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm thử hoạt tính chống oxy hóa của cây bán chi liên
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7
Nồng độ mẫu (mg/ml) 0.03 0,06 0,125 0,25 0,5 1.0 0
Dd methanol (ml) 0 0 0 0 0 0 4
Dd mẫu thử (ml) 4 4 4 4 4 4 0
Thêm 1ml dung dịch DPPH 0,2 mM, lắc đều, để yên trong tối 30 phút Đo OD ở bước sóng 517 nm
Tính kết quả: Hoạt tính chống oxi hóa (HTCO) được tính cơng thức:
HTCO (%) = OCc - ODt x100
ODc Trong đó:
ODc: Mật độ quang của dd DPPH và MeOH (mẫu trắng) ODt: Mật độ quang của dung dịch DPPH và mẫu thử
Từ HCTO (%) và nồng độ mẫu dựng đường chuẩn. Dựa vào đường chuẩn tính được IC50 (khả năng bắt gốc tự do 50% của DPPH của mẫu). Giá trị IC50 càng thấp tương ứng với HTCO càng cao và ngược lại.
+ Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch chiết tới độ hoạt động của enzym alpha-glucosidase:
Dựa trên phản ứng phân cắt cơ chất p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside nhờ tác động của enzym α-glucosidase, qua đó giải phóng sản phẩm là p-nitrophenol có màu vàng.
Nguyên lý của phép thử: Dựa trên phản ứng phân cắt cơ chất p-Nitrophenyl--D- glucopyranoside nhờ tác động của enzyme - glucosidase, qua đó giải phóng sản
phẩm là p-Nitrophenol có màu vàng. Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng tại bước sóng 410 nm ở thời điểm 30 phút sau phản ứng, phản ánh lượng sản phẩm p-Nitrophenol sinh ra, qua đó phản ánh hoạt độ của enzyme - glucosidase.
Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase được thực hiện trên đĩa 96 giếng với tổng thể tích phản ứng là 200 µl/giếng. Mẫu thử được pha lỗng bằng DMSO 100% và nước cất vô trùng đến nồng độ cuối cùng trong phản ứng là 128g/ml và các nồng độ khác theo tỉ lệ pha loãng. Acarbose được sử dụng làm chất tham khảo. Các thành phần phản ứng bao gồm: 40 µl Phosphate buffer 100 mM pH 6,8; 25 µl - glucosidase 0,2 U/ml; 10 µl mẫu thử; 25 µl p-nitrophenyl -D-glucopyranoside 2,5
mM. Ở mẫu đối chứng âm, mẫu thử được thay bằng đệm phản ứng. Thí nghiệm được ủ
ở nhiệt độ 37oC. Sau 30 phút, phản ứng được dừng bằng 100 µl Na2CO3. Độ hấp thụ
của phản ứng được xác định trên máy quang phổ BIOTEK với bước sóng 410 nm (A)[21,22].
Khả năng ức chế enzyme - glucosidase của mẫu thử được xác định bằng công thức: Độ ức chế (%) = [A(đối chứng âm) – A(mẫu thử)] / A(đối chứng âm) x 100%
IC50 (half maximal inhibitory concentration) là nồng độ chất thử ức chế 50% hoạt động của enzyme -glucosidase, được tính bằng phần mềm Tablecurve.
p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (p-NPG)